Для оценки влияния культуры аутологичных и аллогенных фибробластов на лечение рубцового дефекта кожи всем 57-и крысам, участвующим в эксперименте были искусственно созданы модели кожных рубцов.
Модель рубца получали следующим образом. Животное обезболивали с помощью эфирного наркоза, фиксировали к операционному столу. Шерсть удаляли методом химической депиляции. Операционное поле обрабатывали 70% этиловым спиртом, затем проводили линейное рассечение кожи с подкожно-жировой клетчаткой до фасции длиной 5 см, в области спины. К краям раны (для предотвращения контракции) подшивали прямоугольную рамку из индифферентного синтетического материала, которую удаляли на 7-е сутки после начала эксперимента. У всех крыс рану закрывали стерильными салфетками. Через 28 дней рана заживала с образованием атрофического рубца.
Все животные, участвовавшие в эксперименте, были разделены на 3 серии. В первой серии (18 крыс) животными внутрикожным введением трансплантировали культуру аутологичных фибробластов; во второй серии (18 крыс) – в область рубца вводилась культура аллогенных фибробластов; в третьей серии (21 крыса) – рубцы не лечились и служили контролем. Трансплантация клеточной культуры проводилась 3-х кратно с интервалом 2 недели, начиная с 28-х суток после операции.
В течение всего срока эксперимента животных ежедневно осматривали, отмечали их общее состояние, активность, характер шерстяного покрова, состояние раны и рубца. Животные выводились из эксперимента на 7-е сутки после 1-й, 2-й, 3-й трансплантаций и через 2, 4, 8 недель после окончания лечения. Во все указанные сроки забирали материал для цитоморфологического исследования (таб.1).
Морфологический анализ осуществляли в области рубцового дефекта с прилежащей кожей. Серийные парафиновые срезы толщиной 7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону, орсеином по Унна-Тенцеру для выявления эластических волокн. По всем сериям и срокам эксперимента было изготовлено и изучено – 564 гистологических препаратов. Гистологические срезы изучали, анализировали и фотографировали с помощью системы анализа изображений на базе Pentium 4, состоящей из светового микроскопа Olympus и цифрофой фотокамеры Olympus С 310.
Для объективизации морфологической картины работа была дополнена проведением морфометрии гистологических срезов. Измеряли толщину эпидермиса, дермы и гиподермы, считали суммарную плотность волосяных фолликулов в дерме с использованием аналитической системы визуализации «Видео Тест – Морфо» («ВТ – М» - Россия, г. Санкт – Петербург; рег. уд. МЗ РФ № 29/20010702/6102 – 04).
Таблица 1
Характеристика серий эксперимента на лабораторных животных
и сроки взятия биопсии
Серии животных Сроки биопсии | Животные после трансплантации аутологичных фибробластов (1 серия) | Животные после трансплантации аллогенных фибробластов (2 серия) | Животные без лечения (3 серия) | всего |
Рубец 28 суток без лечения | - | - | 3 | 3 |
Рубец 35 суток, через 7 суток, после 1-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Рубец 49 суток, через 7 суток после 2-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Рубец 63 суток, через 7 суток после 3-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Рубец 70 суток, через 14 суток после 3-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Рубец 84 суток, через 28 суток после 3-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Рубец 102 суток, через 56 суток после 3-й трансплантации | 3 | 3 | 3 | 9 |
Всего | 18 | 18 | 21 | 57 |
Первичную культуру фибробластов получали по общепринятой методике первичных эксплантов ( 1983; с соавт., 1988; с соавт., 2000).
Весь цифровой материал исследований на лабораторных животных обработан с помощью метода вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента. Значимость отличий средних арифметических опыта и контроля оценивалась при постоянно заданном уровне значимости (р < 0,05).
Клинический раздел работы основан на результатах лечения 61 пациента с атрофическими рубцами постакне, проходившим амбулаторное лечение в косметологическом отделении Красоты» (Самара). В клинической практике определена эффективность интрадермальной трансплантации культуры аутологичных фибробластов по сравнению с традиционным лечением методом химического пилинга на основе 15% трихлоруксусной кислоты, «модифицированной».
Критериями включения пациентов в группы сравнения были: атрофические рубцы постакне, наличие информированного добровольного согласия пациента.
Критериями исключения пациентов из основной группы являлись: тяжелые хронические заболевания, острые и хронические заболевания кожи, наличие злокачественного новообразования, беременность и лактация, курение и нежелание отказа от него на период лечения.
Критериями вывода пациентов из основной группы являлись: требование пациента об отказе от исследования на любом его этапе, заключение врача о неблагоприятном влиянии проводимой терапии на пациента, индивидуальная непереносимость.
При проведении исследования проводилась оценка безопасности трансплантации культуры аутологичных фибробластов.
Оценивался вид реакции на введение клеточной культуры: фармацевтическая (за счет неклеточных компонентов препарата), фармакодинамическая (прямое действие клеток), токсическая воспалительная реакция кожи, острая аллергическая, отсроченная аллергическая.
Степень тяжести реакции оценивалась как: легкая, умеренная, тяжелая, очень тяжелая.
Определялась степень достоверности побочной реакции клеточного материала по следующей градации: прямая степень достоверности, вероятная степень достоверности, возможная степень достоверности, сомнительная степень достоверности, отсутствие связи побочной реакции с введением препарата, серьезная побочная реакция, представляющая угрозу жизни пациента SAE!
Для клинико-диагностической оценки эффективности проводимой терапии использовались следующие критерии:
1. Отличный результат: выравнивание «минус-ткани» на уровне с нормальной кожей, нормальный цвет рубца.
2. Хороший результат: выравнивание «минус-ткани» на 50% и более, нормальный цвет рубца.
3. Удовлетворительный результат: выравнивание микрорельефа кожи и уменьшение глубины рубца менее чем на 50%.
4. Неудовлетворительный результат: отсутствие выравнивания «минус-ткани».
Оценку результатов проводили после окончания лечения, а также 1, 3 и 6 месяцев спустя.
Переносимость клеточного материала и выраженность возможных нежелательных реакций на клеточный материал (побочных эффектов) при лечении оценивалась по бальной шкале:
- 0 баллов (побочных действий нет);
- 1 балл (побочное действие есть, субъективно не ощущается, регистрируется врачом, не опасно и не требует отмены введения культуры клеток);
- 2 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом, не опасно и требует отмены введения культуры клеток);
- 3 балла (побочное действие есть, субъективно ощущается, регистрируется врачом и требует лечения).
При лечении больных применяли культуру аутологичных фибробластов кожи, использование которых одобрено Этическим комитетом на заседании № 34 от 21.09.05 и Ученым советом ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» от 01.01.2001 (протокол №3).
Клеточную культуру дермальных аутофибробластов получали по стандартной технологии в лаборатории культур клеток ЦНИЛ СамГМУ.
Перед выдачей клеточной культуры проводили контроль контаминации на ВИЧ, сифилис, вирусные гепатиты В и С, микоплазму, цитомегаловирус, герпес методом ПЦР и ИФА. На каждый клеточный материал выдавался паспорт. Для трансплантации использовали культуру 4-10 пассажей в виде суспензии, в физрастворе.
В группы сравнения вошел 61 пациент с атрофическими рубцами постакне с локализацией на лице. В основной группе было 30 человек, группу сравнения составил 31 больной, с сопоставимой патологией.
Все пациенты имели множественные депрессированные рубцы в виде ямок, диаметром от 1,5 до 5-6 мм. Местами они сливались с образованием рубцового дефекта с фестончатыми краями.
По степени зрелости выделяли «молодые» рубцы, со сроком существования от 3 до 12 месяцев и «старые» или «окончательно зрелые», со сроком существования 1 год и более. По степени зрелости рубцы распределились таким образом.
В основной группе 16 человек (53,3 %) имели «молодые» рубцы, а 14 человек (46,7%) – «старые» рубцы.
В группе сравнения 15 человек (48,4%) имели «молодые» рубцы, а 16 человек (51,6%) – «старые» рубцы (таб. 2).
Таблица 2
Распределение пациентов в группах наблюдения
Основная группа | Группа сравнения | |
Больные с «молодыми» рубцами | 16 | 15 |
Больные со «старыми» рубцами | 14 | 16 |
Всего | 30 | 31 |
У всех пациентов в обеих группах сравнения рубцы локализовались на лице и являлись эстетически неприемлемыми. Субъективные ощущения в области рубцов и признаки воспалительного процесса на лице отсутствовали.
Проанализировав известные на сегодня методы лечения атрофических рубцов кожи, мы выбрали неинвазивный, современный, не дающий серьезных осложнений метод – химический пилинг на основе 15% трихлоруксусной кислоты (ТСА), «модифицированной». По глубине проникновения пилинг был срединным.
Пациентам из группы сравнения (31 человек), с целью выравнивания рельефа кожи в области рубцов, проводили местное лечение по предложенному способу. Пилинг проводился 4-х кратно с интервалом в 2 недели, затем через 6 недель курс повторяли. Лечение в данной группе на этом было закончено.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
