Гистохимическая характеристика иннервационных структур пищевода (стр. 2 )

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Иннервация пищевода кошки, крысы и человека изучалась на всем протяжении, включая верхнюю, среднюю и нижнюю трети. Исследование проводилось на белых половозрелых крысах-самцах (массой 150-165 грамм), содержащихся в стандартных условиях вивария (n=17), кошках (n=6) и аутопсийном материале (n=8). Материал обрабатывали в течение 20 мин после забоя; эвтаназия крыс проводилась путем декапитации. Исследовались кошки, погибшие от травм или во время операций и не имевшие к моменту смерти патологии органов пищеварения. Пищевод изымался на всем протяжении для изготовления продольных и поперечных срезов.

Аутопсийный материал получен при судебно-медицинской экспертизе (n=8), от умерших или погибших в возрасте 32-65 лет от случайных причин, не связанных с патологией органов пищеварения. Из пищевода (верхняя, средняя и нижняя части) вырезали кусочки до 1,5 см для изготовления продольных и поперечных срезов.

В работе использованы морфологические (импрегнация азотнокислым серебром по Кахалю, окраска гематоксилин-эозин, окраска метиленовым синим), гистохимические (NADPH-диафораза, метод Келле, метод Фурнеса и Коста с глиоксиловой кислотой), электронномикроскопический и морфометрические методы.

1. Морфологические методы. Кусочки пищевода толщиной 0,5 фиксировали в нейтральном формалине и импрегнировали in toto по методу Кахаля и изготовляли срезы толщиной от 25 до 30 мкм. Цитоархитектоника и структура нейронов пищевода изучалась с применением окраски гематоксилин-эозином и метиленовым синим; окраска производилась по общепринятой методике (Меркулов, 1968).

2. Гистохимические методы. Холинергические нервные проводники устанавливали на препаратах, приготовленных на криостате по активности ацетилхолинэстеразы тиохолиновым методом Келле. Препараты выдерживали в инкубационной среде, используя в качестве субстрата ацетилтиохолин йодистый. Инкубацию проводили в термостате при постоянной tº-ре 37ºС от 30 мин до 2х часов. Для определения биогенных аминов использовали флуоресцентно-гистохимический метод Фурнеса и Коста с глиоксиловой кислотой. Флуоресценцию продуктов реакции наблюдали и фотографировали на люминесцентном микроскопе МЛ-2 при свете с длиной волны 390 – 410.

NADPH-диафоразу, исследовали методом предложенным Hope, Vincent (1989). Метод позволяет диагностировать морфологию нейронов за счет выявления тел и отростков. Изучение состояния фермента проводилось на срезах, взятых из верхней, средней и нижней частей пищевода. Материал погружали в охлажденный, приготовленный на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) 4% параформальдегид, который из всего класса диафораз сохраняет активность только NADPH-диафоразы; два часа фиксировали при температуре 4ºС, затем сутки промывали при той же температуре в 15% растворе сахарозы. Из замороженных в криостате срезов изготавливали образцы толщиной 10 мкм, монтировали на предметные стекла и помещали в среду. Инкубацию проводили в течение 60 мин при температуре 370С, после чего ополаскивали в дистилляте, обезвоживали и заключали в бальзам. Обработку изображения проводили с помощью программ Adobe Photoshop 5.0. Активность фермента выражали в единицах оптической плотности (ЕОП).

3. Электронная микроскопия. Для электронной микроскопии кусочки материала размером 1-2 мм фиксировали в 2-5% растворе глютаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере (ph 7,3) в течение двух часов при tº-ре 4ºС. Дофиксацию проводили в 1% 4окси осмия в течение двух часов при той же температуре. Обезвоживали материал в спиртах возрастающей крепости от 70º до 100º. После чего материал заливали в смесь эпона-812 и эралдита. Из блоков изготавливали срезы, которые изучали в электронном микроскопе на базе института микробиологии.

4. Морфометрия. Морфометрическую обработку данных проводили с помощью видеосистемы, смонтированной на микроденситометре Olimpus (видео-тест-5.0) Определяли величину мышечных клеток, количество нейронов, среднюю площадь нейрона, среднюю площадь ядра, толщину аксона; высчитывали среднее арифметическое, стандартную ошибку и критерий различий. Разницу между средними арифметическими считали достоверной при значении р<0,05.

Использованные методы и количество изготовленных препаратов представлено на табл. 1.

Таблица 1

Методы и количество изученных препаратов

Методы	Количество изученных препаратов
крыса (n=17)	кошка (n=6)	человек (n=8)
NADPH-диафоразу	20	10	20
Импрегнация по Кахалю	-	-	15
Метиленовым синим	12	9	12
Гематоксили-эозин	8	8	8
Келле	10	-	-
Фурнеса и Коста	10	-	-
Электронная микроскопия	12	-	10

Результаты исследования и их обсуждение

Оболочки пищевода, имея определенную автономность, образуют орган как целое. Орган имеет ключевые нервные механизмы, обеспечивающие его интегративную деятельность. В плане относительной автономности оболочек, особенностей их иннервации и васкуляризации мы подведем некоторые общие итоги наших исследований.

Одной из наиболее заметных структур адвентициальной оболочки пищевода мы считаем наличие в ней небольших групп нейронов. Гетеротопические псевдоуниполяры установлены у человека, кошки, крысы (табл. 2). Они - постоянные образования адвентиции и являются чувствительным элементом местных рефлексов. В адвентиции пищевода у всех исследованных видов установлены довольно крупные нервы. Они делятся на ветви разной толщины, которые частично пенетрируют мышечную оболочку. В составе нервов имелись как мякотные волокна толщиной 12–18 мкм, так и типичные безмякотные кабельной организации. В цитоплазме одной швановской клетки находилось 10–20 аксонов диаметром от 0,3 до 1 мкм.

Перерезкой блуждающего нерва у крыс установлено, что в нервах адвентиции имеются преимущественно мякотные преганглионарные волокна. В то же время тонкие амиелиновые аксоны молиниформного вида сохраняли анатомическую целостность и, очевидно, были симпатическими. Цитохимическая ревизия нервов показала наличие в них адренергических аксонов и вывод об их симпатической природе не может быть оспорен.

Таблица 2

Морфометрические характеристики чувствительных нейронов
адвентиции пищевода

Вид	Кол-во нейронов в группе «усл. узле»	Ср. S (в мкм2) нейрона	Ср. S ядра (в мкм2)	Оптическая Плотность осадка на NADPH-d (ЕОП)	Активность NO-синтазы	Примечания
Человек (n=8)	9,0±3,2	732±32,1	168±8,1	0,493±0,2	высокая	Спорадические нейроны имеют S=1641 мкм2 и не реагируют на NADPH-d
Кошка (n=6)	12±2,1	710±41,2	156±6,9	0,539±0,19	высокая
Крыса (n=17)	10±1,5	705±39,6	170±12,2	0,546±0,3	высокая

Адвентиция пищевода является источником интерорецепторных рефлексов. Толстые мякотные нервные проводники, исключая преганглионарные волокна, являются чувствительными, так как образуют в наружной оболочке пищевода типичные по строению древовидные и клубочковые рецепторы.

Из трех исследованных нами видов наиболее мощное развитие имеет мышечная оболочка человека. На протяжении оболочки имеется несколько сужений и расширений. В связи с клиническим значением особое внимание получил нижний пищеводный сфинктер. Мышечная оболочка пищевода человека структурно и функционально на протяжении органа заметно меняется. В верхних отделах она состоит из поперечно-полосатой мышечной ткани, а в нижних отделах оболочку формируют гладкие мышечные клетки (ГМК). Однако обе ткани функционально автономны, их работа не контролируется сознанием. У крысы мышечная оболочка на всем протяжении пищевода образована поперечно-полосатой мышечной тканью. У кошки эта ткань в нижней поддиафрагмальной части полностью заменяется ГМК.

Взаимодействие между нервами и мышечным вооружением пищевода является одной из особо важных проблем. Прямыми микроскопическими наблюдениями нами установлено, что с мышцами взаимодействуют постганглионарные холинергичесике волокна местных нейронов. Таких волокон, как показывают наши исследования, довольно много. Они образуют на мышцах характерные терминали с двигательной функцией. Структура двигательного аппарата лучше определяется импрегнацией материала азотно-кислым серебром. Терминали имели гроздевидный тип и напоминали двигательную бляшку. Сходные терминали установлены нами при исследовании нитрооксидсинтазы.

В циркулярном слое гладких мышц пищевода человека такие гроздевидные аппараты идентифицировались неоднократно, иногда группами на ограниченном участке мышечной ткани. Наличие терминалей на мышцах пищевода окончательно доказано электронномикроскопическими исследованиями. На электроннограммах видны профили холинергических и адренергических окончаний, расположенных от ГМК на расстоянии 250 нм – 1,5 мкм. Однако это не препятствует аксональному комплексу взаимодействовать с мышцами путем объемной нейротрансмиссии.

Мы полагаем, что в регуляции мышц пищевода решающее значение имеют не нервные окончания, а многочисленные варикозные утолщения аксона. Система этих утолщений позволяет вовлекать в рабочий акт одновременно группы мышечных волокон и воздействовать на всем их протяжении.