Генетические особенности helicobacter pylori и полиморфизм генов IL1B и IL10 в прогнозе хронической гастродуоденальной патологии у детей (стр. 2 )

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты исследования внедрены в работу 3-го корпуса ГАУЗ «ДРКБ МЗ РТ», педиатрического отделения ГАУЗ «Клиника медицинского университета». Материалы диссертации используются в педагогическом процессе при обучении студентов, интернов, ординаторов на кафедре пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» МЗ РФ.

Структура диссертации и ее объем

Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, иллюстрирована 30 таблицами и 25 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, трех глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 194 источника, в том числе 106 отечественных и 88 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на клинической базе кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета ГБОУ ВПО «Казанский ГМУ» МЗ РФ: в гастроэнтерологическом и соматическом отделениях ГАУЗ «Детская городская клиническая больница №2» г. Казани (гл. врач – ) (с 2013 г. - 3-й корпус ГАУЗ «ДРКБ» МЗ РТ, гл. врач – ). Получение информированного согласия, сбор анамнеза, предварительное обследование и забор биологического материала проводили с разрешения локального этического комитета КГМУ.

Под наблюдением находилось 135 детей в возрасте от 7 до 17 лет, в том числе 23 пациента с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки (ЯБ ДПК), 87 больных хроническим гастродуоденитом (ХГД) и 25 условно-здоровых детей того же возраста (группа контроля). Пациенты с ХГД, вошедшие в исследование, были госпитализированы в периоде обострения заболевания. Большинство детей с ЯБ ДПК (87%) поступили в стационар для получения противорецидивного лечения, у 3 пациентов (13%) заболевание было выявлено впервые (схема 1).

I этап: комплексная клинико-лабораторная оценка состояния здоровья детей в возрасте от 7 до 17 лет, поступивших в ДГБ № 2 г. Казани.

 

II этап: выявление генетических и клинико-морфологических особенностей течения Н. pylori-ассоциированной патологии гастродуоденальной области у 110 детей.

 

 

Схема 1 - Дизайн исследования

Критерии включения пациентов в основную группу исследования:

- родители и дети, вошедшие в исследование, должны подписать форму информированного согласия,

- пациентам должен быть выставлен диагноз хронической гастродуоденальной патологии, подтвержденной морфологически,

- хроническая гастродуоденальная патология должна быть ассоциирована с инфекцией Н. pylori.

Всем больным проводились общепринятые клинико-инструментальные методы исследования, включающие анализ анамнестических данных из историй развития детей, результатов анкетирования детей и их родителей по специально разработанным анкетам, объективное обследование больного. Параклинические методы обследования включали: общий и биохимический анализ крови, анализ кала на яйца глистов и цисты лямблий, копрологический анализ и анализ мочи. Из инструментальных методов были проведены: эзофагогастродуоденоскопия (ЭГДС), УЗИ органов брюшной полости, ЭКГ и дуоденальное зондирование по показаниям. Для морфологического подтверждения хронического воспаления во время ЭГДС пациентам проводили взятие биопсийного материала слизистой оболочки антрального отдела желудка [ и соавт., 1998]. Мазки-отпечатки окрашивали по Романовскому-Гимзе. Выраженность нейтрофильной и лимфоцитарной инфильтрации слизистой оболочки, наличие кишечной метаплазии эпителия оценивали по обновленной Сиднейской системе (Хьюстонский вариант) в баллах: нормальная — 0, легкая — 1, умеренная — 2, выраженная — 3 [Dixon M. F, 1996] (врач-цитолог ).

Специальные методы исследования включали тесты на выявление H.pylori у пациентов: дыхательный Хелик-тест, разработанный (г. Санкт-Петербург), цитологический метод исследования и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) биоптатов с детекцией ureC гена микроорганизма.

Для оценки результатов диагностических тестов на определение H.pylori в качестве «золотого стандарта» был принят цитологический метод. Расчет ценности диагностических методов исследования Н. pylori проводили по формулам расчета чувствительности, специфичности, общей точности, вероятности хеликобактериоза при «+» результате и вероятности хеликобактериоза при «-» результате.

Дальнейший диагностический поиск был связан с выявлением основного гена патогенности H.pylori cagA и генетических особенностей ребенка (полиморфизмы –511T/C гена IL1B и -1082G/A гена IL10), а также количественным определением про - (ИЛ-8, ИЛ-1β, ФНО-α) и противовоспалительного (ИЛ-10) цитокинов в сыворотке крови методом иммуноферментного анализ (ELISA) с помощью наборов фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) на базе ФБУН КНИИЭМ Роспотребнадзора (врач-лаборант, к. м.н. ).

Ген сagA островка патогенности Н. pylori в биоптатах определяли по стандартной методике с использованием наборов реагентов «Хеликопол» НПФ «Литех» (Россия).

Для молекулярно-генетического анализа использовали образцы ДНК пациентов, выделенных сорбентным методом в соответствии с прилагаемой инструкцией с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК «Проба-ГС» ДНК-Технология» (г. Москва). Полиморфизмы –511T/C гена IL1B и -1082G/A гена IL10 определяли методом ПЦР и последующего рестрикционного анализа с использованием двухпраймерной системы (Santtila S., 1998).

Статистическую обработку, применяемую для оценки достоверности результатов, проводили при помощи программных пакетов Microsoft Excel 2003, BIOSTATISTICA и «GraphPad InStat». Для оценки связи между признаками непараметрических данных применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) и критерий Пирсона для параметрических данных. Для выявления риска развития события в сравниваемых группах применяли расчет отношения шансов (Odds Ratio, OR) и соответствующие 95% доверительные интервалы (ДИ). Сравнительный анализ основывался на определении достоверности разницы показателей по F-критерию Фишера. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез в исследовании принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В результате проведенного исследования выявлено, что Н. pylori являлся этиологическим фактором заболеваний желудка и ДПК у 83,9% обследованных больных (у 110 из 131 пациентов): у 100% больных, страдающих ЯБ ДПК, и 80,5% - ХГД), что соответствует распространенности хеликобактериоза у детей с хронической патологией гастродуоденальной области г. Казани, равной 73,6% – 94,2% (р<0,05), а у пациентов с ХГД – 66% – 95% (р<0,05).

Сравнительный анализ детей с ЯБ ДПК и ХГД выявил факторы риска развития язвенного дефекта:

- мужской пол (среди пациентов с ЯБ ДПК мальчики встречались в 78,3%, а девочки – в 21,7% (р˂0,05),

- пубертатный период (средний возраст пациентов с ЯБ ДПК составил 15,4±3,5 лет, а детей с ХГД - 13±2,9 лет),

- наследственная отягощенность по язвенной болезни, что может свидетельствовать, кроме генетических особенностей, о существовании внутрисемейных очагов хеликобактериоза (родственники, больные язвенной болезнью были выявлены у 60,9% пациентов с ЯБ ДПК и 19,5% больных ХГД, (р˂0,05). Также показано, что при отсутствии семейной предрасположенности к ЯБ ДПК даже развившийся ХГД протекал чаще в форме поверхностных изменений слизистой оболочки желудка и ДПК. Это свидетельствует об особенностях реагирования организма ребенка на инфекцию H.pylori, что может быть запрограммировано генетически.

Сравнение данных, полученных при диагностике H.pylori, показало, что наибольшее количество ИП результатов выявлено при исследовании с помощью дыхательного теста (ИП=110), меньше – при диагностике ПЦР (ИП=103). При исследовании с помощью ПЦР было обнаружено наибольшее число ИО результатов (ИО=31) в отличие от Хелик-теста (ИО=25). ЛП данные чаще всего были получены при исследовании дыхательным тестом (ЛП=21), реже – при ПЦР (ЛП=10). При диагностике сравниваемыми методами было выявлено большое количество ЛО ответов (при применении Хелик-теста ЛО=6, при ПЦР ЛО=7 соответственно).

Таким образом, дыхательный Хелик-тест и ПЦР при верификации инфекции H.pylori показали одинаково высокую Se (94,8% и 93,6% соответственно), но низкую Sp (80,6% и 79,5% соответственно) и высокую вероятность хеликобактериоза при отрицательных результатах методов (19,4% и 18,4% соответственно). Было выявлено, что общая точность и прогностическая ценность положительного ответа при диагностике с помощью ПЦР (88,7% и 91,2% соответственно) выше, чем у Хелик-теста (83,3% и 84% соответственно) (таблица 1).

Таблица 1 - Характеристика методов диагностики Н. pylori – инфекции при хронической гастродуоденальной патологии у детей

Показатели	Хелик-тест	ПЦР	Хелик-тест + ПЦР
Чувствительность	94,8%	93,6%	98,3%
Специфичность	80,6%	79,5%	93,5%
Вероятность хеликобактериоза при положительном результате	84%	91,2%	96,6%
Вероятность хеликобактериоза при отрицательном результате	9,4%	18,4%	6,4%
Общая точность	83,3%	88,7%	96%

В связи с выявлением низкой Sp (Хелик-тест = 80,6%, ПЦР = 79,5%) и высокой вероятности H.pylori-инфекции при отрицательных результатах методов (Хелик-тест = 19,4%, ПЦР = 18,4%) было решено оценить диагностическую ценность тестов при их комбинации.