МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ К ПРОВЕДЕНИЮ
ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ И ИЗУЧЕНИЮ СВОЙСТВ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ПУТЕМ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕТОДОВ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ
,
Тема: Использование методов генного зондирования для изучения свойств патогенных бактерий
Цель занятия: Знать принципы использования методов молекулярного зондирования и методику проведения молекулярной гибридизации для определения tох+ гена дифтерийной бактерии, контролирующего продукцию экзотоксина.
Основные вопросы темы:
1. Принципы методик генного зондирования.
2. Цели использования методов генного зондирования в диагностике инфекционных болезней и изучении свойств патогенных бактерий.
3. Механизмы синтеза дифтерийного экзотоксина.
4. Схема проведения молекулярной гибридизации с целью определения токсигенности культур дифтерийной бактерии.
Самостоятельная работа:
1. Ознакомиться с принципом методов генного зондирования и целями их использования.
2. Изучить методику проведения молекулярной гибридизации с целью обнаружения tох+ гена дифтерийной бактерии.
3. Используя методические указания и таблицу № 1 провести исследование дифтерийной культуры на присутствие tох+ гена.
4. Провести учет результатов исследования и сделать заключение.
Методические указания, к выполнению самостоятельной работы
Задание 1. Ознакомиться с принципом методов генного зондирования и знать цели его применения.
Быстро развивающееся в биологии и медицине направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей ДНК и РНК получило название генного зондирования. В его основе - способность НК к гибридизации, т. е. образованию двухцепочных структур за счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов (Аденин-Тимин, Гуанин-Цитозин). Для определения искомой последовательности ДНК (РНК) специально создается так называемый зонд - полинуклеотид с определенной последовательностью оснований. В качестве молекулярных зондов применяют препараты геномной ДНК, гидролизованной на фрагменты, иногда - рибосомальную РНК.
В состав молекулярного зонда вводят специальную метку (радиоактивную, ферментную и др.), позволяющую идентифицировать образование комплекса (см. рис.1).
Рис.1. Схема реакции генного зондирования.
|
|
Предварительно пробу ДНК (РНК) микроорганизма денатурируют с целью получения одноцепочных структур. С этими структурами и реагируют молекулы ДНК (РНК) - зонда.
Различают несколько разновидностей генного зондирования: молекулярная гибридизация (анализ ДНК) по Саузерну, Nothern-Blot (анализ РНК), точечная гибридизация, гибридизация in situ (на срезе, в мазке), полимеразная реакция амплификации (ПЦР).
Процедуру проведения анализа можно разделить на следующие стадии:
1. Подготовка исследуемых образцов, включая выделение и денатурацию ДНК. Для этого используют выращенные колонии бактерий и клеточные культуры вирусов. Так же может быть проведен непосредственный анализ образцов сыворотки крови, мочи, ликвора, гнойного отделяемого и соскобов слизистой оболочки и др. материала на присутствие инфекционного агента.
Для выделения ДНК (РНК) возбудителей (микроорганизмов) проводят лизис клеток (например, додецил сульфатом натрия), а затем лизат образца обрабатывают щелочью, что приводит к денатурации ДНК (перевод её в одноцепочную форму).
2. Фиксация образцов на носителе (чаще всего используют полимерный
мембранный фильтр) путем инкубации при 80 С в течение 10 мин.-
4 час. в вакууме.
3. Предгибридизация - инактивация свободных мест связывания для
уменьшения неспецифического взаимодействия зонда с мембраной.
4. Собственно гибридизация. Процесс гибридизации занимает 2-20 час.,
что зависит от концентрации ДНК в образце, концентрации используемого зонда и его размеров.
5. Отмывание несвязавшихся продуктов.
6. Учет результатов.
Таким образом, методы генного зондирования можно использовать с целью определения возбудителей инфекционных болезней (ВИЧ, L. pneumoniae и др.) в материале от больных, и изучения свойств патогенных микроорганизмов (например, наличия tox+ генов).
Задание 2. Изучить методику проведения метода молекулярного зондирования с целью определения токсигенности возбудителя дифтерии.
Способность дифтерийной бактерии продуцировать экзотоксин связана с лизогенизацией умеренными фагами, в геноме которых присутствует tох+ ген. Именно эта способность дифтерийной бактерии имеет основное значение в патогенезе дифтерийной инфекции.
Метод молекулярной гибридизации может быть использован для определения токсигенности культур дифтерийных бактерий путем обнаружения у них tох+ гена.
Для проведения исследования необходимы:
1. Лизат исследуемой культуры дифтерийной бактерии (ИК), полученный обработкой додецил сульфат натрия и лизоцимом.
2. Нитроцеллюлозная мембрана (фильтр).
3. Лизат стандартной токсигенной культуры дифтерийной бактерии (C. diphtheriae tox+).
4. Лизат стандартной нетоксигенной культуры дифтерийной бактерии(C. diphtheriae tox-).
5. Нормальная ДНК, выделенная из тимуса (ДНК).
6. Молекулярный зонд - участок ДНК с tox+ геном, контролирующим
продукцию дифтерийного токсина (МЗ).
7. Бычий сывороточный альбумин (БСА).
8. Антитела против молекулярного зонда, меченные пероксидазой хрена.
9. Субстрат-индикаторный раствор (ортофенилендиамин + Н2О2 + цитрат - фосфатный буфер).
10. Стоп - реагент (2М раствор серной кислоты).
11. Микропипетки.
Механизм и схема проведения молекулярной гибридизации
Для определения tох+ гена в хромосоме дифтерийной бактерии необходимо получить однонитевую ДНК исследуемой культуры, а затем инкубировать её вместе с фрагментом ДНК, содержащим tох+ ген с введенной в него меткой (молекулярный зонд). Если на хромосомной ДНК имеются участки, комплементарные для tох+ гена, то ДНК-зонд свяжется в этом месте с хромосомной ДНК и получатся гибридные участки ДНК с встроенным зондом. Этот зонд можно выявить по введенной в него метке (радиоактивные изотопы, флуоресцеины, биотин и др.). В предлагаемом варианте молекулярный зонд выявляют путем взаимодействия его как антигена с антителами, меченными пероксидазой хрена.
Схема проведения молекулярной гибридизации:
I этап. На ацетатцеллюлозную мембрану наносят:
1. 10 мкл лизата исследуемой культуры, полученного обработкой её SDS и лизоцимом (опыт) - 1-е пятно.
2. 10 мкл лизата стандартной токсигенной культуры (положительный контроль) - 2-е пятно.
3. 10 мкл лизата стандартной нетоксигенной культуры (отрицательный контроль) - 3-е пятно.
Мембрану с этими исследуемыми образцами (пятнами) укладывают в чашку Петри и помещают в сушильный шкаф на 15 мин при 80ºС.
II этап. С целью блокировки неспецифической фиксации ДНК мембрану
с образцами (пятнами) заливают раствором нормальной ДНК. Время
инкубации 15 мин при 80 С. Затем раствор сливают.
III этап. На мембрану наносят на каждое пятно раствор молекулярного зонда (0,05 мкг/мл). Этот зонд содержит участок ДНК с tox+ геном, контролирующим выработку дифтерийного токсина. Чашку Петри с мембраной выдерживают 15 мин при 80ºС в сушильном шкафу.
IV этап. Раствор молекулярного зонда (MЗ) сливают, мембрану промывают 3 раза раствором БСА.
V этап. На мембрану в зоне каждого пятна наносят раствор антител
против зонда, меченных ферментом пероксидазой хрена, инкубируют
в термостате при 37ºС 15 мин. Отмывают 3 раза физиологическим
раствором.
VI этап. Вносят субстрат-индикаторный раствор на каждое пятно. Выдерживают 15 мин при комнатной температуре в темной коробке.
VII этап. Вносят стоп-реагент и учитывают результаты реакции. См. табл. 1.
Если в исследуемом образце ДНК - зонд нашел комплементарный участок, и произошла гибридизация, то здесь фиксируются антитела к зонду и произойдет ферментативное реагирование пероксидазы хрена с субстрат - индикаторным раствором. Исследуемый образец окрасится в желто-коричневый цвет (положительная реакция). Такое же окрашивание произойдет в зоне расположения положительного контроля. Окраски не будет в зоне расположения отрицательного контроля.
Таблица 1.
Схема проведения молекулярной гибридизации с целью выявления tox+ гена в хромосоме дифтерийной бактерии
№ п/п | Ингредиенты | пятна на мембране в мкл | ||
1 | 2 | 3 | ||
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. | Лизат исследуемой культуры дифтерийной бактерии Лизат токсигенной культуры дифтерийной бактерии Лизат нетоксигенной культуры дифтерийной бактерии Нормальная ДНК Молекулярный зонд Антитела против зонда, меченные пероксидазой хрена Субстрат - индикаторный раствор Стоп-реагент | 10 - - 20 30 20 20 20 | - 10 - 20 30 20 20 20 | - - 10 20 30 20 20 20 |
Контрольные вопросы по теме:
1. Что такое генное зондирование?
2. Для каких целей могут быть использованы методы генного зондирования?
3. Какие Вы знаете методы генного зондирования?
4. В каких случаях дифтерийная бактерия продуцирует экзотоксин?
5. Что такое молекулярный зонд?
6. Объясните принцип проведения молекулярной гибридизации с целью выявления tох+ гена у дифтерийной бактерии.
7. Какими способами можно обнаружить гибридные участки ДНК со встроенным молекулярным зондом?
