Телевизионная визуализация и обработка изображений люминесцирующих объектов в криминалистике, молекулярной биологии и медицине (стр. 23 )

Анализ выражений (5), (10) показывает, что для идеальной системы, в которой Е = 0, W = 0 отсутствуют ограничения для повышения чувствительности ПЛ и мощности ИВЛ с целью обнаружения слаболюминесцирующих объектов с максимальным значением контраста при Аф = 0.

Наличие в системе люминесцирующего фона с площадью S0, превышающей площадь объекта Sф, не только уменьшает контраст получаемого изображения, но и негативно сказывается на эффективности использования динамического диапазона ФП, реагирующего на интегральный световой поток.

Такая ситуация весьма характерна при визуализации продуктов ПЦР, когда люминесцирующая в широком спектре поверхность геля на порядок больше площади люминесцирующих меток. Таким образом, принимая во внимание выражение для интегральной чувствительности системы:

,

как фототок насыщения i, рассчитанный на один люмен светового потока Ф, выделим в световом потоке две составляющие:

Ф0 ~ А0×S0,

Фф ~ Аф×Sф,

где Ф0 – световой поток от люминесцирующего объекта;

Фф – световой поток от люминесцирующего фона.

Составляющие фототока определяются как:

i = i0 + iФ,

где i0 = h А0 S0 – фототок от объекта,

iф = h Аф Sф – фототок от фона.

Тогда выражение для контраста в идеальной системе приобретает вид:

(11)

Выражение (11) позволяет учесть влияние характера сюжета на параметры получаемого изображения.

С учетом всех рассмотренных выше фоновых составляющих и интегрального характера чувствительности системы, выражение (5) может быть скорректировано следующим образом:

(5.1)

Аналогичным образом может быть скорректировано и выражение (10).

Проведем анализ выражения (11) применительно к изображению геля с продуктами ПЦР, получаемыми при диагностике инфекционных заболеваний.

Для изображений данного класса можно принять условие:

Тогда для обеспечения К > 0,05, необходимо иметь ,

что при 8-разрядном кодировании амплитуды видеосигнала достигается, например, в случае величины фона Аф £ 24 при величине сигнала объекта А0 = 255, соответствующей максимуму динамического диапазона. При этом предполагается раздельное измерение интенсивности свечения фона и интенсивности свечения объекта в отсутствии фона при одинаковых значениях Р(l).

Ограничим предельно обнаруживаемый контраст в реальной системе значением К > 0,03. Тогда предельные значения для , что обеспечивается, например, в условиях ограничения паразитных составляющих Рл и Gп до величин, не превышающих 0,1 от уровня соответствующих им полезных составляющих, при наличии аналогичного уровня подавления паразитных составляющих светофильтрами С1 и С2.

5. Улучшение качества люминесцентных изображений

Цифровое шумоподавление. Яркостная коррекция. Масштабирование. Цветовая трансформация. Цветовое контрастирование.

Для изображений люминесцирующих объектов характерны яркостные перепады по отношению к темному фону. Для идеального изображения уровень фона соответствует уровню черного в видеосигнале. В зависимости от интенсивности свечения люминесцирующие объекты могут перекрывать все яркостные градации динамического диапазона. Для слаболюминесцирующих объектов минимальный уровень сигнала соответствует уровню собственных шумов фотоприемника и маскируется им.

Методы внутрикадровой цифровой обработки [56] для таких изображений оказываются неэффективными. Так, например, операции сглаживания, вместе с некоторым подавлением шумов, приводят к «размытию» яркостных перепадов, а медианная фильтрация устраняет только одиночные шумовые выбросы.

Изображения фотолюминесцирующих объектов статичны, поэтому для улучшения их качества можно применять межкадровую обработку. Весьма эффективен в этом случае метод цифрового шумоподавления [57] , позволяющий уменьшить шумы в изображении за счет усредняемых (накапливаемых) телевизионных кадров. Без цифрового шумоподавления невозможно получение качественного изображения люминесцирующего объекта, поэтому данную операцию следует отнести к разряду обязательных для ТСС функций.

Структурная схема цифрового шумоподавителя приведена на рис. 2.5.1.

Рис. 2.5.1. Структурная схема цифрового шумоподавителя:

S(t) – входной сигнал; S(t + Tk) – сигнал, задержанный на время кадра Tк; S(t) – усредненный сигнал; n – количество усредняемых кадров

При наличии ЭВМ в составе ТСС цифровой шумоподавитель реализуется программным путем. На рис. 2.5.2 показана эффективность программного усреднения сигнала изображения люминесцирующих объектов.

а) б) в)

Рис. 2.5.2. Изображение: а – с выхода ТВ-камеры; б – после аналоговой обработки в УКВС; в – после усреднения за 255 кадров

Усредненное изображение может быть дополнительно улучшено за счет контрастирования методом преобразования яркостей, сущность которого заключается в перераспределении значений яркостей исходного изображения в пределах заданного динамического диапазона. Для определения границ диапазона яркостей исходного изображения обычно используется гистограмма их распределения. Для интенсивно люминесцирующих объектов гистограмма имеет два ярко выраженных пика, соответствующих наиболее часто встречающимся значениям фона и сигнала (рис. 2.5.2).

а б

Рис. 2.5.3. Гистограмма распределения яркостей для люминесцирующих ПЦР-продуктов
в геле: а – пик фона; б – пик сигнала

В случае слабой люминесценции пик сигнала выражен слабо или не выражен совсем. На рис. 2.5.4 показан результат яркостного преобразования изображений люминесцирующих ПЦР-продуктов в геле.

а б

Рис. 2.5.4. Изображения люминесцирующих ПЦР-продуктов в геле до (а)
и после коррекции (б)

Яркостная коррекция с целью удаления фона необходима всегда при дальнейшем автоматизированном количественном анализе и весьма полезна для визуального контроля с целью улучшения субъективного восприятия изображения [58].

К операциям над изображениями, полезными при исследовании люминесцирующих объектов, следует отнести масштабирование и поворот на заданный угол. Не останавливаясь на них подробно, укажем некоторые особенности, связанные с использованием данных операций. При масштабировании необходимо выбирать некоторый компромисс между степенью увеличения и допустимой величиной укрупняющейся при этой апертуре (рис. 2.5.5).

а б в

Рис. 2.5.5. Укрупнение апертуры при масштабировании: а – исходное; б – ´2; в – ´4

При повороте изображения возникает необходимость дополнительной операции по «заливке» фоном пустот, появляющихся в углах (рис.2.5.6).

а б в

Рис. 2.5.6. Иллюстрация заполнения пустот при повороте изображения для
масштабирования: а – исходное; б – результат поворота; в – результат заливки

С точки зрения повышения информативности изображения, получаемого при люминесцентных исследованиях с помощью ТСС, весьма интересен рассмотренный в [59] метод цветовой трансформации, при котором получают интегральное цветное изображение из трех изображений, снятых в различных участках спектрального диапазона с присвоением каждому из них одного из трех основных цветов – зеленого, красного и синего.

Метод цветового контрастирования изображения, при котором различные градации яркости окрашиваются в соответствии с некоторой цветовой палитрой, может также оказаться достаточно эффективным, особенно при исследовании структуры люминесцирующих биологических объектов.

6. Количественный анализ изображений люминесцирующих продуктов ПЦР

Оценка количества и размеров ДНК. Построение профилограмм распределения интенсивности свечения ПЦР-продуктов в геле.

Одной из наиболее важных задач при исследовании ПЦР-продуктов в гелях является получение оценок количества и размеров ДНК, содержащихся в люминесцирующих фрагментах и полученных в результате электрофоретического разделения проб.

Количество ДНК – M пропорционально интенсивности – I свечения фрагмента и может быть определено следующим образом: