Методы генетической трансформации (стр. 2 )

Рис. 1. Соединение молекул ДНК с помощью наращивания poly (dA)- и poly(dT)-концов (коннекторным методом). (Страйер,1985).

Эти гомополимерные последовательности синтезируются терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазой - ферментом, присоединяющим нуклеотиды к 3'-гидроксильной группе цепи ДНК. Этот фермент, в отличие от ДНК-полимеразы, не зависит от матрицы, поэтому с его помощью можно присоединить последовательности из нуклеотидов только одного типа (обычно длиной 100 остатков). Ро1у(dА)-концы одной молекулы ДНК отжигают с poly(dT)-концами другой. Длины этих концевых последовательностей могут несколько колебаться, поэтому, прежде чем соединить цепи ДНК-лигазой, бреши заполняют с помощью ДНК-полимеразы. Точно так же можно использовать для соединения различных молекул ДНК и концевые poly(dG)- и poly(dC) последовательности.

Третий подход к соединению молекул ДНК сочетает преимущества метода липких концов с универсальным характером (dA—dТ)-метода (коннекторного). К концам фрагмента ДНК или вектора ковалентно присоединяют химически синтезированный линкер, то есть связующую цепь (длиной от шести до десяти пар оснований), чувствительную к расщеплению ферментом рестрикции. 5'-концы десятинуклеотидного линкера и молекулы ДНК фосфорилируют полинуклеотидкиназой и соединяют лигазой, которая может образовывать ковалентную связь между молекулами ДНК с тупыми концами. Если обработать эти концевые участки соответствующим ферментом рестрикции, образуются липкие концы (рис. 2).

Рис. 2. Образование липких концов путем присоединения и расщепления химически синтезированного линкера (Страйер,1985)

Таким образом, почти у любой молекулы ДНК можно вызвать образование липких концов, соответствующих специфичности данного фермента рестрикции.

Глава 2. Трансфекция и трансформация

Доставка генов в клетки с помощью невирусных векторов кажется привлекательной по ряду причин. Во-первых, их использование более безопасно по сравнению с вирусными векторами (если произойдет рекомбинация вирусного вектора с каким либо эндогенным элементом, например, ретровирусным, то образуется вирус, способный к репликации). Во-вторых, невирусные векторы способны переносить большие фрагменты ДНК. Тем не менее одним из существенных минусов доставки генов невирусными методами является низкая эффективность.

При конструировании невирусных векторов используют ген, встроенный в плазмиду, представляющую собой протяженную нестабильную молекулу ДНК. Для успешной доставки плазмиды через плазматическую и ядерную мембраны в клетку-мишень необходима защита ДНК от механической и энзиматической деградации с обеспечением долговременной экспрессии трансгена в клетках-мишенях.

ДЭАЭ-декстрановый метод.

Диэтиламиноэтилдекстран (ДЭАЭ-декстран) связывается с нуклеиновыми кислотами и с клеточной мембраной, за счет чего увеличивает эффективную концентрацию ДНК на поверхности клеток и стимулирует пиноцитоз, не захватываясь при этом клетками.

Кальций-фосфатный метод предполагает смешение ДНК с хлоридом кальция и добавление его в фосфатно-буферный раствор, при этом добавлении смеси в фосфатно-буферный раствор образуется осадок, который вносят в среду, омывающую клетки. Эти комплексы из фосфата кальция и ДНК поглощаются клетками, которые начинают впоследствии экспрессировать введенный ген. Недостатками такого метода являются высокая токсичность и низкая эффективность (1-5% комплексов достигает ядра). Особенно при использовании кольцевых молекул ДНК ДЭАЭ-декстрановый метод является намного эффективней кальций-фосфатного. Наконец, метод сложно использовать in vivo.

Катионные полимеры часто используются для генной доставки, так как они способны легко образовывать комплексы с ДНК. Комплексы ДНК и полимеров, иначе известные как полиплексы, взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхностью клеточной мембраны, что приводит к проникновению ДНК в клетку. Наиболее часто используемыми поликатионами являются поли-L-лизин, хитозан и полиэтиленимин. Метод также считается малоэффективным в отношении процента трансфицированных клеток.

Метод липофекции. Термин липосома означает липидный бислой, который образует коллойдную частицу в водной среде. Метод липофекции обладает большей эффективностью доставки генов, способностью трансфицировать специфические клетки, которые устойчивы к кальций-фосфатному методу, с его помощью можно переносить молекулы разных размеров от олигонуклеотидов до РНК и даже белков. Метод подходит для использования in vivo.

Катионная часть липидных молекул взаимодействует с отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. В результате электростатических сил образуется их комплекс. Общий положительный заряд комплекса приводит к увеличению эффективности проникновения в клетку, так как осуществляет более тесную ассоциацию комплекса с отрицательно заряженной клеточной мембраной (рис. 4). Включение небольшого количества анионного липида в липосому приводит к ассоциации ДНК с внутренней поверхностью мембраны липосом, что защищает ДНК от ферментативной деградации. Слияние липосомы с клеточной мембранной происходит путем эндоцитоза или путем слияния с плазматической мембранной. Основным недостатком этого метода является низкая эффективность (т. е. большая часть генетического материала, проникшего в клетку, связывается с плазматическими органеллами, подвергаясь деструкции, и лишь небольшая часть достигает ядра). Только одна из 100 проникших в клетку плазмид попадает в ядро и начинает экпрессироваться. Также существенным недостатком является необходимость подбирать липосомный агент к каждому конкретному типу клеток. Для липофекции нейронов наибольшее распространение получил Lipofectamine 2000. Существует еще множество синтетических липидов, например: Lipotaxi, SuperFect, Fugene, TransFast, Dosper, GenePORTER.

Рис. 3. Общая структура синтетических катионных липидов. X, Y,Z- число возможных заместителей, в зависимости от конкретных липидов.(www. )

Рис. 4. Схематичное изображение различных механизмов трансфекции и нейтрализации ДНК (www. )

Прямая микроинъекция. ДНК трансфицируется с помощью микроиглы с диаметром кончика порядка 400-900 нм. Гены доставляются непосредственно в ядро, что значительно повышает вероятность встраивания плазмиды в геном клетки и, следовательно, способствует более стабильной экспрессии трансфицированного белка. Тем не менее, аппарат является дорогостоящим, а сам метод очень трудоемкий, поэтому не подходит для исследований, которые требуют большого количества клеток для трансфекции. Кроме того, метод применим лишь к малым молекулам ДНК, которые не будут повреждаться при прохождении через микрокапилляр. Так же, для осуществления прямой микроинъекции клетки должны обладать большим ядром.

Рис. 5. Схема пересадки ядер. 1- капсула-держатель,2- бластомер, 3-ядро для пересадки, 4- стекло для упора, 5-изотонический раствор 6- подача давления для пересадки ядра (Никитин, 2003)

Электропорация. Этот метод получил широкое распространение. Принцип его работы основан на приложении достаточно большой разности электрических потенциалов к липидному бислою, при котором наблюдается пробой мембраны: в ней образуются проводящие поры, через которые возможна диффузия различных гидрофильных веществ, в том числе ДНК и РНК.

Различают:

·  Электропорацию клеточных суспензий

·  Электропорацию единичных клеток

·  Электропорацию in vivo

Электропорация клеточных суспензий применяется в основном для различных клеточных линий. Суспензия клеток в растворе, содержащем ДНК (РНК), помещается в кювету между двумя металлическими пластинами. Между этими пластинами пропускается электрический импульс определенной формы, длительности и частоты, что приводит к образованию пор в плазматической мембране клеток и попаданию внутрь клеток нуклеиновой кислоты.

Электропорация единичных клеток и электропорация in vivo. Электропорация осуществляется с помощью электрода, подведенного к клетке (или к области, в случае in vivo), где необходимо выполнить трансфекцию. При подаче импульса внутри электрода, содержащего раствор ДНК (РНК), создается небольшое давление, что приводит к попаданию нуклеиновой кислоты в клетку. Метод трудоемкий, т. к. необходимо проводить манипуляции с каждой клеткой отдельно.

Рис.6. Схема электропорации клеточной суспензии нейронов (Teruel et al, 1999)

Метод генного пистолета позволяет осуществлять трансфекцию единичных клеток. ДНК сорбируют на наночастицы благородных металлов (золото или вольфрам), а затем с помощью «пистолета» выстреливают (с использованием либо электрического разряда, либо под давлением импульса газа, обычно гелия) в трансфицируемые клетки. Метод прост в использовании и требует небольшого количества ДНК (РНК), а так же демонстрирует высокий уровень экспрессии. Подходит как для срезов мозга и нейрональных культур, так и для in vivo.

Рис.7. Схема модифицированного генетического пистолета (John et al, 2006)

Магнетофекция представляет модификацию метода «генного пистолета» (рис. 8). ДНК (РНК) сорбируется на намагниченные наночастицы (1), затем суспензию этих наночастиц добавляют в среду, омывающую клетки (2). Трансфицирующие частицы помещаются на несколько минут (~10 мин) в магнитное поле, которое транспортирует наночастицы с молекулами ДНК внутрь клеток.