Методы генетической трансформации (стр. 3 )

Рис. 8. Принцип магнетофекции (Plank et al, 2003)

Фототрансфекция. Доставка ДНК осуществляется через поры в плазматической мембране, которые образуются при облучении небольшого участка клеточной мембраны короткой (порядка фемтосекунды) вспышкой лазера. Этот метод демонстрирует достаточно высокий уровень общей и избирательной трансфекции. Демонстрирует отсутствие каких-либо отрицательных последствий на рост и деление клеток, а также показывает малое количество погибших клеток или зарегистрированного апоптоза и, наконец, возможность определения интенсивности флуоресценции и обработки изображений с того же микроскопа. В том числе, существует возможность передачи чужеродной ДНК безопасно и эффективно в специфические типы клеток (в том числе стволовые клетки).

Все эти методы подходят и для трансформации прокариотических клеток.

Табл.1 Методы трансфекции невирусными векторами, их преимущества и недостатки (Саложин, 2009 с дополнениями)

Метод	Преимущества	Недостатки
ДЭАЭ-декстрановый	·  простота ·  компоненты легкодоступны и недороги	·  низкая эффективность ·  токсичность
Кальций-фосфатный	·  компоненты легкодоступны и недороги ·  протокол прост в использовании ·  подходит для разных типов клеток	·  высокая токсичность ·  низкая эффективность ·  не подходит для использования in vivo
Катионные полимеры	·  компоненты легкодоступны и недороги ·  протокол прост в использовании ·  подходит для разных типов клеток	·  токсичность ·  низкая эффективность ·  не подходит для использования in vivo
Липофекция	·  простота ·  способность трансфицировать специфические клетки ·  переносит молекулы разных размеров ·  подходит для использования in vivo.	·  низкая эффективность ·  сравнительно высокая токсичность ·  необходимость подбора подходящего липосомального реагента
Электропорация клеточных суспензий	·  достаточно высокая эффективность	·  можно использовать только для клеточных культур ·  экспрессия внесенных генов сильно снижается со временем
Электропорация in vivo	·  достаточно высокая эффективность	·  очень малый объем ткани, в котором производиться трансфекция
микроинъекция	·  не токсичен ·  доставка непосредственно в ядро	·  трудоемкость ·  возможность работать с клетками с большими ядрами
«генный пистолет»	·  возможность использовать на срезах тканей и единичных клетках	·  вероятность механического повреждения клетки ·  нельзя использовать in vivo
магнетофекция	·  возможность использовать на срезах ·  очень высокая скорость доставки конструкций (~10 мин)	·  трудоемкость изготовления наночастиц ·  нельзя использовать in vivo
фототрансфекция	·  возможность вносить материал в различные места клетки	·  трудоемкость ·  нельзя использовать in vivo

Глава 3. Трансдукция

Трансдукция – это перенос генетического материала из одной клетки в другую с использованием вирусных частиц. Основой трансдукции является существование особой категории вирусов, генетический материал которых способен встраиваться в хромосому заражаемой клетки.

Явление трансдукции впервые обнаружили американские учёные Ледерберг и Циндер в 1952 году при изучении возможности генетического обмена у сальмонелл. Херши и Чейз в 1952 году показали, что при заражении фагом в клетки внедряется только ДНК фага; они предположили, что механизм трансдукции связан с определенным генетическим взаимоотношением ДНК фага и ДНК донора. Затем, в 1957 году, Уодингтон оценил эволюционное значение открытия трансдукции (переноса) бактериальных генов от одного вида бактерий к другому через инфицирование бактериофагом и уже тогда предположил возможность существования подобного механизма переноса генетической информации не только у прокариот, к которым относятся бактерии, но и у эукариот. В 1965 году советский генетик Гершензон обнаружил, что вирус, вызывающий одну из болезней тутового шелкопряда, переносит от одного насекомого к другому гены, определяющие окраску яиц. Следовательно, перемещение генов с помощью вирусов может происходить как у бактерий, не имеющих настоящего ядра, так и у сложных клеток многоклеточных животных. Вирусная трансдукция возможна не только между клетками одного вида, но и между клетками разных видов высших организмов. В опыте она была произведена, например, между культивируемыми клетками мыши и человека, между клетками дрозофилы и кишечной палочкой.

Трансдукцию широко используют для модификации генома бактерий, растений и животных. Внесение дополнительных генов позволяет увеличить или изменить синтез тех или иных веществ. Сейчас в сельском хозяйстве широко применяются растения с геномом, в который. внедрены гены морозостойкости или устойчивости к засухе.

Виды трансдукции.

В настоящее время выделяют три основных типа вирусной трансформации генома.

1. Неспецифическая трансдукция – характеризуется тем, что ДНК вируса внедряется в любую область хромосомы заражаемой клетки. При этом могут переноситься самые разнообразные участки хромосомы донора.

2. Специфическая трансдукция – заключается в том, что ДНК вируса присоединяется к строго определенному месту хромосомы хозяина.

3. Абортивная трансдукция – характеризуется тем, что фрагмент ДНК-донора не включается в хромосому клетки-реципиента, а остается в ее цитоплазме и в таком виде способен поддерживаться и проявляться фенотипически.

Так как использование полноценных вирусов привело бы к развитию инфекции и гибели клеток, в молекулярной биологии применяют неполноценные вирусы. При создании подобных векторов из генома вируса чаще всего исключаются участки, отвечающие за фазы цикла, связанные с выходом вируса из клеток. Это позволяет сохранить инфицированные клетки живыми.

Любой вектор должен обеспечивать стабильное наследование рекомбинантных ДНК в автономном состоянии. Кроме того, вектор должен иметь дополнительные характеристики, например, содержать маркер, инактивирующийся при встройке в него чужеродной ДНК.

Способность генно-инженерных конструкций на основе вирусных векторов проникать в клетки-мишени определяется белками оболочки вируса, взаимодействующими с рецепторными структурами, экспрессированными на клеточной поверхности. Выбор вирусов в качестве векторов обусловлен их естественной способностью специфически связываться с клеткой и проникать в нее. В качестве средства доставки генетического материала используются системы на основе аденовирусов, аденоассоциативного вируса, вируса простого герпеса, ретровирусов и лентивирусов. Также созданы системы векторов на основе папилломавирусов, вируса оспы крупного рогатого скота.

Первые векторы разрабатывались на основе вируса обезьян (SV40). Применяя рестриктазы, удаляют определенные области вирусного генома и замещают их чужеродными сегментами ДНК. В зависимости от того, какой именно сегмент ДНК удаляется, образуется тот или иной вектор. Различают три типа векторов: 1) трансдуцирующие SV-векторы, реплицирующиеся в соответствующих клетках-хозяевах и упаковывающиеся в вирионы; 2) плазмидные SV-векторы, способные реплицироваться, но не упаковываться. В этом случае трансфицированные клетки могут использоваться для изучения временной экспрессии генов, встроенных в векторные молекулы; 3) пассивные трансформирующие векторы, которые не способны ни реплицироваться, ни упаковываться. Они лишь доставляют в клетку клонированные сегменты ДНК, которые затем внедряются в ДНК клетки животного и реплицируются как часть клеточного генома. Такие векторы напоминают челночные, поскольку сначала для клонирования и выделения рекомбинантных ДНК используют клетки E. сoli. Сегменты ДНК вируса, включаемые в подобные векторы, содержат области регуляции транскрипции и сайты полиаденилирования. На практике использование вектора на основе вируса SV40 особенно эффективно при доставке генов в нейроны.

Одним из самых распространенных способов трансдукции является разделение вирусного генома на несколько значимых плазмид. Такой подход облегчает сборку вирусных конструктов и делает использование вирусных векторов более безопасным. Изначально геном вируса делится на три части или три независимые плазмиды. Две плазмиды кодируют белки, ответственные за упаковку, репликацию и проникновение (эти плазмиды называют вспомогательными, или хелперными); третья плазмида содержит генетическую информацию об интересующей нас структуре – эта плазмида называется информационной.

Каждая из плазмид способна проникать в клетку E. Сoli и реплицироваться там по принципу «катящегося» кольца. Генетической информации, содержащейся в каждой из этих плазмид, не достаточно для сборки полноценного вируса. Такие плазмиды могут быть внедрены в восприимчивые эукариотические клетки, например, НЕК-клетки (Human Embryonic Kidney). Если в одной НЕК-клетке встретятся все три плазмиды, то может собраться полноценный вирусный вектор. Количество вирусных векторов, имеющих полноценную вирусную оболочку, систему проникновения в восприимчивые клетки и репликации вирусных белков в одной НЕК-клетке может достигать миллионов копий. Однако, такие вектора не способны выйти из клетки и реинфицировать окружающие клетки, так как гены, ответственные за данный процесс, чаще всего полностью элиминированы из вирусного генома.

В настоящее время используют вектора на основе самых разнообразных вирусов:

Вирус папилломы является двухцепочечным ДНК - вирусом, который может вызывать доброкачественные и злокачественные опухоли. Идентифицированно 12 типов вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV-1 до 13). Папилломавирус крупного рогатого скота (ВРV) реплицируется в клетках животных в виде стабильной независимой плазмиды, поскольку вирионы могут образовываться только в терминально дифференцированных эпидермальных клетках. Векторы на основе ДНК папилломавируса конструируют лигированием чужеродных вставок с так называемым «трансформирующим» сегментом вирусного генома, то есть только с теми генами, которые необходимы для поддержания трансформированного состояния клеток. Гены капсидных белков в векторе отсутствуют. Обычно получают челночные векторы для клонирования в E. сoli. и клетках животных.