Особенности адгезивных взаимодействий эндотелия сосудистой стенки и тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом (стр. 2 )

Внедрение в практику

Разработанные дополнительные критерии диагностики нарушений функций эндотелия и сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза внедрены в практику работы Саратовского научно-исследовательского института кардиологии.

Материалы диссертации используются при чтении лекций, проведении практических занятий на кафедре фармакологии и клинической фармакологии Саратовского государственного медицинского университета.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в отечественных изданиях, одна из них в рецензируемом журнале.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 4 рисунками. Список литературы содержит 214 источников, из них 75 отечественных и 139 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клиническое состояние больных оценивали по классификации Канадской ассоциации кардиологов. Под нашим наблюдением находились 146 больных ИБС: 116 человек с острым коронарным синдромом, 30 больных со стабильной стенокардией II-III функциональных классов и 10 клинически здоровых лиц.

Группу больных с ОКС (116 человек) составили: 75 мужчин в возрасте от 35 до 64 лет (средний возраст 49,5±4,5 года) и 41 женщина в возрасте от 49 до 64 лет (средний возраст – 56, 5±2,3 года).

В исследование включались больные с ОКС не позднее 6 часов от начала развития заболевания. Диагноз ОКС ставился на основании жалоб пациентов, данных клинического наблюдения, характерных изменений на ЭКГ (наличие патологического зубца Q или комплекса QS, наличие изменений по сегменту ST), подъема активности креатинфосфокиназы, ее МВ-фракции, лактатдегидрогеназы, динамики аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз.

В зависимости от особенностей клинического течения ОКС все больные были разделены на две группы: без подъема и с подъемом сегмента ST на ЭКГ. Первую группу составили 62 человека. Среди них было 34 мужчины и 28 женщин в возрасте от 35 до 64 лет (средний возраст 49±4,5 года). Во вторую группу вошли 54 человека – 41 мужчина и 13 женщин в возрасте от 40 до 64 лет (средний возраст – 52,2±3,4 года).

Критериями включения в группу сравнения со стабильной стенокардией напряжения (30 пациентов) являлись: типичный анамнез заболевания, жалобы больных на загрудинные боли, характер клинического течения болезни, а также проба с дозированной физической нагрузкой. Пробу с дозированной физической нагрузкой проводили на велоэргометре типа 380В фирмы “Siemens”, снабженным электронным устройством, позволяющим при различном числе оборотов педалей сохранить одну и ту же мощность рабочей нагрузки в положении больного сидя при ступенчатом увеличении нагрузки. Нагрузку начинали с 25 Вт. При отсутствии показаний для прекращения ВЭМ-пробы мощность нагрузки увеличивалась до субмаксимальной, то есть такой, при которой частота сердечных сокращений достигала 75% от максимальной возрастной по таблице Shephard. Пробу прекращали в соответствии с общепринятыми критериями ВОЗ.

В группу больных стенокардией II-III функциональных классов были включены 30 человек в возрасте от 42 до 60 лет (средний возраст 51,2±2,5 лет). Критериями исключения из исследования были: наличие признаков нарастающей сердечной недостаточности, повышение уровня артериального давления до 180 и 110 мм рт. ст. и выше в покое, появление признаков прогрессирующей стенокардии.

Группу больных стенокардией напряжения составили 30 больных IV функционального класса в возрасте от 50 до 60 лет (средний возраст 50,5±0,5 года). Критериями исключения из исследования являлись больные с клиническими признаками застойной сердечной недостаточности, сопутствующей гипертонической болезнью, перенесенным инфарктом миокарда.

Контрольную группу составили 10 клинически здоровых доноров – добровольцев в возрасте 41-50 лет (средний возраст 45,5±1,4 года). Из исследования исключались добровольцы, имеющие заболевания, которые могли бы оказать влияние на систему гемостаза (сахарный диабет, другие эндокринные патологии и т. д.), а также имеющие отклонения в общеклинических и биохимических анализах крови.

Из исследования исключались больные старше 65 лет; пациенты, имеющие осложнения в первые 6 часов от начала развития заболевания, а также пациенты с тяжелыми сопутствующими заболеваниями, которые могли бы оказать значимое влияние на систему гемостаза и уровень эндотелина-1.

Для решения поставленных задач в работе был применен комплекс различных методов исследования: клинических, биохимических, иммунологических. В группах больных с ОКС забор крови осуществляли в утренние часы натощак. До взятия крови больные не получали антикоагулянты и им не проводилась тромболитическая терапия.

Для оценки состояния сосудодвигательной функции эндотелия сравнивали реакцию плечевой артерии на нитроглицерин с реакцией на усиление кровотока (реактивную гиперемию) ( с соавт., 2000). В наших исследованиях у больных с ОКС мы руководствовались общепринятыми критериями оценки дисфункции эндотелия и считали отсутствие достоверных отличий между реакцией плечевой артерии на нитроглицерин и реакцией на реактивную гиперемию, как сохраненную функцию эндотелия. Вычисленную разницу между реакцией артерии на нитроглицерин и на реактивную гиперемию мы использовали в качестве показателя дисфункции эндотелия (ПДЭ).

Определение агрегационной активности тромбоцитов: забор крови (10 мл) у больных проводили пункцией локтевой вены в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9 : 1. Кровь центрифугировали при 200g в течение 7 минут для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП), отбиралось 2,5 мл супернатанта. Приготовленная к исследованию ОТП разливалась по 0,3 мл в кюветы для агрегометра.

Исследование агрегации тромбоцитов проводилось на двухканальном анализаторе агрегации тромбоцитов LA – 230 фирмы «Биола Лтд.» (г. Москва). В качестве индуктора агрегации применялся аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 1 мкМ (Jefferson J. et al., 1998). Расчет агрегации тромбоцитов проводился в ОТП при концентрации тромбоцитов 200 тыс/мкл. Для определения концентрации тромбоцитов использовался лазерный анализатор агрегации фирмы «Биола Лтд».

Определение параметров агрегации проводили по кривой среднего размера агрегатов тромбоцитов. После калибровки прибора размер одиночных тромбоцитов принимался за 1,0.

Учитывались такие параметры как спонтанная (Vo), индуцированная агрегация – максимальный размер образующихся агрегатов (Vmax) и максимальная скорость образования наибольших тромбоцитарных агрегатов (Slope), определяемая как максимальный наклон кривой среднего радиуса, а также аналогичные характеристики второй волны агрегации при ее наличии.

Определение уровня эндотелина-1, а также уровней sICAM и sVCAM проводили при помощи ИФА-анализатора «Stat Fax» с использованием набора реактивов фирмы «Amersham kit».

Метод определения экспрессии интегриновых рецепторов основан на анализе величины свечения мембраны тромбоцитов (экспрессии), как результата реакции антиген-антитело. Взаимодействие на мембране гликопротеинов-интегринов (антигенных детерминант) проводили с соответствующими хромогенчувствительными моноклональными антителами при помощи иммуноферментного анализа.

Для определения экспрессии интегриновых рецепторов использовали моноклональные антитела к поверхностным антигенам тромбоцитов человека. Тестирование поверхностных антигенных детерминант в наших исследованиях проводили с помощью соответствующих моноклональных антител CD w41 против человеческих GP IIb/IIIa.

Применение моноклональных антител дает возможность с помощью проточной цитометрии или люминесцентной микроскопии быстро и качественно определить экспрессию интегриновых рецепторов на поверхности тромбоцитов.

Забор крови (10 мл) у больных проводили пункцией локтевой вены в пластиковые пробирки с цитратом натрия (3,8%) в соотношении 9:1. Кровь центрифугировали при 200 g в течение 10 минут для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Для проведения исследований использовался стандартный 96-луночный микропланшет. Каждая лунка микропланшета инкубировалась с 300 мкл 0,1% раствора коллагена в течение 5 минут при t=4°С. Зетам лунки троекратно отмывали раствором Тироде и инкубировали с 100 мкл суспензии тромбоцитов в течение 40 минут, после чего лунки также отмывали троекратно раствором Тироде. Адгезированные тромбоциты подсчитывали при помощи фазово-контрастного микроскопа в расчете на 1 мм в 5 различных полях зрения. Свободные места связывания на микропланшете блокировали инкубацией 100 мкл 3% раствора альбумина в течение 30 минут. После удаления блокирующего раствора в лунки добавляли 100 мкл моноклональных антител в разведении 1:20, 1:200, 1:500 и инкубировали 30 минут. Моноклональные антитела инкубировали с 100 мкл хромогенного субстрата ABTS (Boeringer Manheim, FRG). Экспрессию интегриновых рецепторов определяли при длине волны 450 нм.

Получение и обработка плазмы крови для определения Р-селектина (Michelson A., 1996): плазму здоровых доноров и больных ИБС получали из крови, антикоагулированной 3,8%-ным раствором цитрата натрия (рН=7,4). Кровь центрифугировали при 1000 g в течение 20 минут при комнатной температуре, отбирали плазму, которую затем дополнительно центрифугировали 1 час при 1000 g в центрифуге для удаления возможной примеси мембранных микрочастиц тромбоцитов. Плазму, лишенную Р-селектина, получали, пропуская донорскую плазму методом проточной цитометрии с использованием меченого фибриногена (фибриноген – FITC) и специфических моноклональных антител к Р-селектину – CD w 62.

Определение уровня фибриногена проводили по Р. Рутберг (1961).

Результаты исследования и их обсуждение

Поскольку одно из центральных мест в регуляции сосудистого тонуса, активации процессов тромбогенеза и пролиферативной активности клеток медии сосудов принадлежит веществам семейства эндотелинов, нами был исследован уровень эндотелина-1 в крови пациентов с различными клиническими вариантами ОКС, а также у больных со стабильной стенокардией.