Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (стр. 3 )

Идентичные кластеры генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы (sps-spp-pfkB-ams), обнаружены нами у других представителей метанотрофов (Methylomicrobium album BG8 и Methylobacter tundripaludum SV96), а также у не растущих на метане метилобактерий (Methylophaga aminisulfidivorans MP и Methylophaga thiooxydans DMS010). У Methylomonas methanica MC09, в отличие от других метанотрофов, ген амилосахаразы расположен дистантно, т. е. отдельно на хромосоме. Кроме того, кластеры sps-spp-pfkB-ams обнаружены у цианобактерии Synechococcus sp. PCC 7002 и хемоавтотрофных протеобактерий (Mariprofundus ferrooxydans PV-1, Thiocapsa marina 5811, Thiomicrospira crunogena XL-1 и Marichromatium purpuratum 984 (Рис. 4).

 

Рис. 4. Структура кластеров генов, кодирующих предполагаемые ферменты метаболизма сахарозы у метилотрофов, хемоавтотрофов и цианобактерий.

У некоторых бактерий структура генного кластера метаболизма сахарозы отличалась от таковой Mm. alcaliphilum 20Z. Так, у галофильных аммоний-окисляющих Nitrosococcus halophilus Nc4 и Nitrosococcus oceani ATCC 19707 гены spp располагаются отдельно на хромосоме, хотя сахарозофосфатфосфатазы этих бактерий филогенетически близки ферменту из Mm. alcaliphilum 20Z (41,3% и 40,1% идентичности, соответственно).

Более того, в хромосоме метилобактерий Mb. flagellatus KT и Methylovorus sp. SIP3-4, а также у хемовтотрофов A. ferrooxidans ATCC_53993 и Nitrosospira multiformis ATCC 25196 отсутствует ген spp. Интересно, что С-концевой домен как растительных, так и большинства цианобактериальных сахарозофосфатсинтаз гомологичен сахарозофосфатфосфатазе [Cumino et al., 2002; Lunn, 2002; Lunn and MacRae, 2003]. На этом основании предположено, что фермент может катализировать как синтазную, так и фосфатазную реакции [Lunn, 2002].

Итак, анализ доступных в Database геномов микроорганизмов выявил у хемоавтотрофных и метилотрофных бактерий присутствие генов, продукты которых проявляют гомологию с ферментами биосинтеза и реутилизации сахарозы, и которые, как правило, локализованы в трех - или четырехгенном кластерах. Однако гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий не изучались. К настоящему времени охарактеризованы только сахарозофосфатсинтазы и сахарозофосфатфосфатазы некоторых растений и цианобактерий, а ферменты утилизации экзогенной сахарозы – только у бактерий, использующих дисахарид в качестве ростового субстрата. В этой связи представлялось интересным определить функциональность генов кластера sps-spp-pfkB-ams у Mm. alcaliphilum 20Z, выделить и охарактеризовать соответствующие ферменты.

3. Определение функциональной роли гена сахарофосфатсинтазы (sps)

Ген sps (GenBank CCE22309.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в векторе pET30a+, далее рекомбинантной плазмидой pETsps трансформировали компетентные клетки E. coli Rosetta (DE3). Экспрессию рекомбинантного белка SPS-His6 индуцировали добавлением ИПТГ. Фермент был очищен из лизата клеток E. coli до электрофоретически гомогенного состояния методом аффинной металл-хелатной хроматографии на колонке с Ni2+-NTA-агарозой. Однако полученный препарат фермента был неактивен. Для определения функциональной роли sps нами был получен мутант с инсерцией канамициновой кассеты в данном гене по схеме мутагенеза, аналогичной таковой для конструирования мутанта ectBC- (Рис. 2). В клетках мутанта, выращенных на метаноле (0,5% по объему) при различной солености среды, определяли содержание сахарозы. Обнаружено, что полученный мутант не накапливал сахарозу. Это свидетельствовало о ключевой роли продукта гена sps в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z, а также о том, что у данного метанотрофа функционирует единственный путь синтеза сахарозы с участием сахарозофосфатсинтазы.

4. Характеристика рекомбинантой сахарозофосфатфосфатазы (SPP).

Ген spp (GenBank CCE22310.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировли в вектор pET28b. Фермент, экспрессированный в клетках E. coli Rossetta (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Согласно данным ДСН-ПААГЭ, электрофоретическая подвижность белка соответствовала м. м. ~35 кДа (Рис. 5А), что согласуется с теоретически рассчитанной м. м. (32,7 кДа). Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом пористости выявил несколько белковых полос с м. м. примерно 35, 70, 150 и 210 кДа, что указывает на возможность существования фермента одновременно в форме мономера, димера, тетрамера и гексамера (Рис. 5Б)

118 кДа 90 кДа 48 кДа 36 кДа 27 кДа 20 кДа

Рис. 5. 12% ДСН-ПААГ электрофорез (А) и нативный градиентный 4-30% ПААГЭ рекомбинантной SPP. 1, 2, 3, 4, 5, – 5, 10, 20 и 40 мкг SPP соответственно, М – молекулярные маркеры.

Рекомбинантный фермент катализировал гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата. Наибольшую активность сахарозофосфатфосфатаза проявляла при 35ºС и рН 6,5 (Табл.1).

Интересно отметить, что оптимумы работы SPP не совпадали с оптимальными условиями роста штамма 20Z (рН 9 и 30oC), но близки таковым у сахарозофосфатфосфатаз из других организмов (Табл. 1). Возможно, это объясняется приобретением генов синтеза сахарозы путем горизонтального переноса от мезофилов.

Зависимость активности SPP от концентрации сахарозо-6-фосфата соответствовала классическому уравнению Михаэлиса-Ментен (Vmax = 18,9±0,6; Km = 36±4 мкМ). Активность сахарофосфатфосфатазы незначительно ингибировалась сахарозой (Ki = 1±0,6 М). Данная константа ингибирования гораздо выше, чем у других охарактеризованных SPP. По-видимому, эта особенность фермента из Mm. alcaliphilum 20Z обусловлена необходимостью поддержания высокой внутриклеточной концентрации сахарозы.

Таблица. 1. Свойства некоторых сахарозофосфатфосфатаз

Параметры	Mm. alcaliphilum 20Z	Synechocystis sp.PCC 6803	Anabaena sp. PCC 7120	Oryza sativa	Pisum sativum
Молекулярная масса субъединицы, кДа	32,7	27	28	50	55
Субъединичная структура	мономер, димер, тетрамер, гексамер	мономер	мономер	димер	димер
pH оптимум	6,5	6,8	6,5	6,5	6,8
Температурный оптимум (oC)	35	-	-	-	-
Km (мМ)	0,036	0,0075	0,35	0,065	0,25
Vmax (Е/мг)	18,9	46	15,7	1250	-
Ki (сахароза) (мМ)	1000	161	80	-	-
Ссылка	Данная работа	[Lunn, 2002]	[Cumino et al., 2001]	[Lunn et al., 2000]	[Whitaker, 1984]

5. Характеристика рекомбинантой амилосахаразы (Ams).

Ген ams (GenBank CCE22312.1) амплифицировали с геномной ДНК Mm. alcaliphilum 20Z и клонировали в вектор pET30a+. Рекомбинантный фермент Ams-His6 экспрессировали в клетках E. coli Rossetta (DE3), очищали аффинной металл-хелатной хроматографией до электрофоретически гомогенного состояния. Электрофоретическая подвижность белка в ДСН-ПААГ соответствовала ~75 кДа (Рис. 6А), что согласуется с расчетной м. м. (76,7 кДа). Нативный электрофорез в градиенте ПААГ (4-30%) выявил единственную полосу с м. м. около 70 кДа (Рис. 6Б), что свидетельствует о мономерной форме фермента.

Рис. 6. 8% ДСН-ПААГ электрофорез (А) и нативный градиентный 4-30% ПААГЭ рекомбинантной амилосахаразы.