Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (стр. 5 )

Таблица 4. Свойства некоторых фруктокиназ прокариот.

Параметры	Mm. alcaliphilum 20Z	Thermococcus litoralis	Bifidobacterium longum	Zymomonas mobilis	Lactococcus lactis
Молекулярная масса субъединицы, кДа	35	35	35	28	32
Субъединичная структура	мономер	димер	мономер	димер	димер
рН-Оптимум	9,0	7,5-8,0	6,0	7,4	7,0
t-Оптимум	60o	80o	50o
Субстратная специфичность	Фруктоза	Фруктоза	Фруктоза	Фруктоза Манноза	Фруктоза Манноза
Km, мМ: Фруктоза ATP	0,25 1,3	2,3 0,81	0,74 0,77	0,7 0,45	0,31 0,59
Vmax, Е/мг белка: Фруктоза АТФ	141	920	1,8	350	-
Относительная активность с донором фосфорильных групп	АТФ (100%), ГТФ (52%), УТФ (22%), ЦТФ (0%), ФФн(0%)	АТФ (100%), ИТФ (73%), ГТФ (62%), УТФ (16%), ЦТФ (16%)	АТФ (100%), ИТФ (78%), ГТФ (23%), ЦТФ (6%), ТТФ (0,18%)	-	АТФ>ГТФ> ИТФ>УТФ
Ссылка	Данная работа	[Qiuhao et al., 2004]	[Caescu et al., 2004]	[Fennington, Hughes, 1996]	[Thompson et al., 1991]

8. Транскрипционная организация генов fruK и ams

Для изучения потенциальной котранскрипции генов fruK и ams, проводили ПЦР с применением обратной транскриптазы (ОТ-ПЦР). кДНК, синтезированную с праймером As-RT, использовали в качестве матрицы для ПЦР с праймерами lp-as-F и lp-as-R. В результате был получен фрагмент ДНК ожидаемой длины - 1010 п. н. Следовательно, гены fruk и ams сцеплены и транскрибируются в виде одной мРНК (Рис. 11).

fruK	ams

1010 п. н.

As-RT

lp-as-R

lp-as-F

Рис. 11. Транскрипционная организация fruK и ams генов. 1 – ПЦР продукт, полученный с кДНК, 2 – ПЦР продукт, полученный с хромосомной ДНК (положительный контроль), 3 – ПЦР продукт, полученный с РНК, не подвергнутой обратной транскрипции (отрицательный контроль).

Одним из продуктов деградации сахарозы под действием амилосахаразы является фруктоза. Котранскрипция генов fruK и ams подтверждает предположение об участии фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образовавшейся при катаболизме эндогенной сахарозы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В частично аннотированном геноме галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z нами впервые обнаружен кластер генов sps-spp-fruK-ams, продуктами которых являются сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза, фруктокиназа и амилосахараза, катализирующие биосинтез и последующий метаболизм сахарозы. Показано, что сахароза накапливается в клетках при увеличении солености среды, но не в ответ на смену источника углерода и энергии с метана на метанол или повышение концентрации метанола в среде. Мутантный штамм, дефектный по генам основного осмопротектора – эктоина, накапливал в 8 раз больше сахарозы, по сравнению с родительским штаммом. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что Mm. alcaliphilum 20Z синтезирует сахарозу в качестве дополнительного осмопротектора.

Достоверно установлено, что кластер sps-spp-fruK-ams присутствует в геномах как галофильных, так и негалофильных метилотрофов с РМФ путем С1-ассимиляции. Кроме того, гомологи этих генов найдены у галофильных и соленезависимых автотрофных протеобактерий с РБФ-циклом. В совокупности, это указывает на иные, нежели осмопротекторная, функции сахарозы у прокариот. Наличие аналогичных генных кластеров метаболизма сахарозы у различных групп прокариот, а также филогенетический анализ аминокислотных последовательностей соответствующих ферментов свидетельствуют о горизонтальном переносе генов, участвующих в биосинтезе и деградации сахарозы.

Впервые из метанотрофов клонированы гены сахарозофосфатфосфатазы, фруктокиназы и амилосахаразы, получены и охарактеризованы гомогенные препараты этих ферментов. Рекомбинантная сахарозофосфатфосфатаза отличалась от ранее охарактеризованных аналогичных ферментов присутствием нескольких олигомерных форм, а также высокой константой ингибирования сахарозой. Эта особенность сахарозофосфатфосфатазы коррелирует с осмопротекторной ролью сахарозы и необходимостью поддержания относительно высокой внутриклеточной концентрации этого дисахарида.

Рекомбинантная амилосахараза Mm. alcaliphilum 20Z, в отличие от описанных амилосахараз гетеротрофных бактерий, имела на порядок более низкую активность и подчинялась кинетике Михаэлиса-Ментен. Низкая активность амилосахаразы может быть также связана с необходимостью поддерживать определенный пул сахарозы в клетке. Инактивация гена ams приводила к увеличению внутриклеточного содержания сахарозы, что подразумевает участие амилосахаразы в катаболизме дисахарида. Поскольку Mm. alcaliphilum 20Z синтезирует гликогеноподобный полисахарид [Khmelenina et al., 1999], логично предположить, что этот метанотроф реализует путь синтеза гликогена с использованием сахарозы в качестве интермедиата.

Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z высокоактивной фруктокиназы, имеющей строгую специфичность и высокое сродство к фруктозе, а также тот факт, что гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной матричной РНК, определенно свидетельствуют в пользу участия данного фермента в активировании образующейся фруктозы для последующего включения в метаболизм.

Клонирование и гетерологичная экспрессия гена sps в E. coli не привели к получению активного препарата сахарозофосфатсинтазы. Однако инактивация гена sps сопровождалась потерей способности культуры синтезировать сахарозу, что подразумевает ключевую роль гена этого фермента в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. В то же время, наличие гена сахарозофосфатфосфатазы указывает на то, что биосинтез сахарозы у данного метанотрофа происходит двухступенчато, с образованием сахарозо-6-фосфата в качестве интермедиата, т. е. путем, функционирующим у растений и цианобактерий [Page-Sharp et al., 1999; Lunn et al., 2000].

Как известно, Mm. alcaliphilum 20Z реализует РМФ-путь ассимиляции формальдегида с образованием фосфогексоз, в частности, фруктозо-6-фосфата и глюкозо-1-фосфата [Хмеленина с соавт., 1997]. Присутствие в геноме данного метанотрофа генов-гомологов АДФ-глюкопирофосфорилазы (YP004918751.1) и УДФ-глюкопирофосфорилазы (YP004918011.1) свидетельствует о том, что синтез сахарозы происходит именно из этих первичных продуктов РМФ-пути (Рис. 12).

Кроме того, присутствие амилосахаразы и фруктокиназы означает, что эндогенная сахароза в некоторых случаях (например, при понижении солености среды) используется для синтеза осмотически инертного гликогена (Рис. 12). Наличие у Mm. alcaliphilum 20Z гена, кодирующего гликогенсинтазу, свидетельствует о том, что гликоген может синтезироваться альтернативным путем. Из приведенной схемы следует, что при синтезе гликогена с участием сахарозофосфатсинтазы и амилосахаразы затрачивается на одну молекулу нуклеозидтрифосфата больше, чем при участии гликогенсинтазы. Можно предположить, что синтез сахарозы с последующей трансформацией в гликоген служит своеобразным футильным циклом, используемым метанотрофом для сброса избыточной метаболической энергии.

Рис. 12. Предполагаемая схема метаболизма сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z.

MMO – метанмонооксигеназа, МДГ – метанолдегидрогеназа, ФАДГ – формальдегиддегидрогеназа, ФДГ – формиатдегидрогеназа, ГФС – гексулозофосфатсинтаза, ГФМ – гексулозо-фосфатизомераза, ФГИ – фосфоглюкоизомераза, ФГМ – фосфоглюкомутаза, УПФ – УДФ-глюкопирофосфорилаза, АПФ - АДФ-глюкопирофосфорилаза, ГС – гликогенсинтаза, SPS – сахарозофосфатсинтаза, SPP – сахарозофосфатфосфатаза, FruK – фруктокиназа, Ams – амилосахараза.

Таким образом, среди прокариот только фототрофы и хемоавтотрофы, а также аэробные метилотрофы способны синтезировать сахарозу. Исходя из высокой гомологии генов и ферментов метаболизма сахарозы у этих групп бактерий, уместно предположить реализацию у них аналогичного биохимического пути. В совокупности, это подтверждает ранее выдвинутую гипотезу общности происхождения автотрофных и метилотрофных прокариот [Whittenbury et al., 1980].

Данная работа инициировала расшифровку путей метаболизма и функциональной роли сахарозы у метилотрофных протеобактерий. Дальнейшие системные исследования особенностей биологии Mm. alcaliphilum 20Z и негалофильных (Methylobacillus flagellatus KT) или термофильных (Methylocaldum szegediense O-12) метилотрофов, включая анализ их генопротеомов и транскриптомов, приведут к лучшему пониманию феномена полифункциональности сахарозы, а также внесут ясность в сценарий эволюции путей метаболизма сахарозы у прокариот.

ВЫВОДЫ

1  . В геноме галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z обнаружен кластер из четырех генов, продукты которых – сахарозофосфатсинтаза (SPS), сахарозофосфатфосфатаза (SPP), фруктокиназа (FruK) и амилосахараза (Ams), участвуют в метаболизме сахарозы.

2  . В экспериментах с мутантами доказано, что сахароза является дополнительным к эктоину осмопротектором. Инактивация двух генов пути биосинтеза основного осмопротектора – эктоина, приводит к 8-кратному увеличению накопления сахарозы в клетках мутанта ΔectBC. Впервые полученный инсерционный мутант по гену сахарозофосфатсинтазы (Δsps) не способен накапливать сахарозу, но при высокой солености среды культивирования синтезирует большее количество эктоина, чем исходный штамм.

3  . Установлено, что рекомбинантная сахарофосфатфосфатаза существует в нескольких олигомерных формах с м. м. 33, 66, 132 и 198 кДа, катализирует гидролиз сахарозо-6-фосфата до сахарозы и неорганического фосфата (Vmax = 18,9±0,6 Е/мг, Kmкаж= = 36±4 мкМ).

4  . Обнаружено, что рекомбинантная амилосахараза является мономером с м. м. 75 кДа, катализирует одновременно гидролиз сахарозы (Vmax = 53±1 мЕ/мг, Kmкаж = 11±1 мМ) и трансгликозилирование с переносом глюкопиранозного остатка сахарозы на гликоген (Vmax = 60±2 мЕ/мг, Kmкаж = 6±1 мМ), тем самым участвуя в деградации сахарозы и образовании полисахарида.

5  . Выявлено, что рекомбинантная фруктокиназа – мономер с м. м. 34,5 кДа, катализирует АТФ-зависимое фосфорилирование фруктозы до фруктозо-6-фосфата (Vmax = 141±6 Е/мг, кажущиеся Kmфруктоза = 0,26±0,03 мМ, KmАТФ = 1,3±0,2 мМ). Гены fruK и ams котранскрибируются в виде одной полицистронной мРНК.

6  . Впервые предложена схема путей метаболизма сахарозы у Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Сахароза синтезируется из интермедиатов рибулозомонофосфатного цикла ассимиляции формальдегида: фруктозо-6-фосфата и УДФ-глюкозы. Последующее превращение сахарозы в гликоген, по-видимому, служит не только для запасания углерода, но и для сброса избыточной метаболической энергии в клетках данного метанотрофа.

Список публикаций по теме диссертации:

Статьи в реферируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1.  , , Троценко рекомбинантной ATP-зависимой фруктокиназы галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Биохимия, 2012, Т. 77, Вып. 4, С. 474 – 480.

2.  , , Троценко и характеристика нокаут-мутантов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектных по генам синтеза сахарозы и эктоина. Микробиология. 2013. Т.82. №2. С. 251-253.

Тезисы докладов:

1. , , Решетников генов биосинтеза сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XV Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2011г. С. 360-361.

2. , Решетников и характеристика рекомбинантных фруктокиназы и амилосахаразы из галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011». Тула, 2011г. С. 37.

3. , , Решетников сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2011г. С. 7-9.

4. , Решетников и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. XVI Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2012г. С.166-167.

5. , Решетников и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Всероссийская молодежная школа-конференция «Актуальные аспекты современной микробиологии». Москва, 2012г. С. 7-9.