Гены и ферменты метаболизма сахарозы у галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (стр. 1 )

На правах рукописи

БУТ СЕРГЕЙ ЮРЬЕВИЧ

ГЕНЫ И ФЕРМЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА САХАРОЗЫ

У ГАЛОТОЛЕРАНТНОГО МЕТАНОТРОФА

METHYLOMICROBIUM ALCALIPHILUM 20Z

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2013

Работа выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов

Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Российской академии наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт микробиологии
им. РАН, зав. лабораторией

доктор биологических наук, профессор

Федеральное государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования

Московский государственный университет

им. , ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт фундаментальных проблем
биологии РАН.

Защита состоится «28» марта 2013г. в 10:00 ч. на заседании Диссертационного совета
Д 002.121.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Российской академии наук

по адресу: Московская область, г. Пущино, проспект Науки, ИБФМ РАН, 142290.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБФМ РАН. Автореферат размещен на официальном сайте Высшей аттестационной комиссии при Министерстве образования и науки Российской Федерации vak. и на сайте Института www. ibpm. ru.

Автореферат разослан «27» марта 2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сахароза - один из основных природных продуктов. Являясь ключевым углеводом растений и цианобактерий, сахароза может синтезироваться двумя путями: с помощью последовательного действия сахарозофосфатсинтазы (SPS) и сахарозофосфатфосфатазы (SPP) с образованием интермедиата сахарозо-6-фосфата или напрямую, под действием сахарозосинтазы (SuS), которая также участвует в деградации этого дисахарида. В настоящее время выделены и охарактеризованы ферменты, участвующие в синтезе сахарозы у высших растений и цианобактерий – сахарозофосфатсинтаза, сахарозофосфатфосфатаза и сахарозосинтаза [Lunn, MacRae, 2003; Hagemann, 2011].

Биосинтез сахарозы - довольно редкое явление у протеобактерий, реализуется у галофильных аэробных метилотрофов с рибулозомонофосфатным (РМФ) путем С1-ассимиляции [Khmelenina et al., 1999; Троценко, Хмеленина, 2008], а гомологи генов биосинтеза сахарозы найдены также в геномах хемоавтотрофов Nitrosomonas europaea, Magnetococcus sp. MC-1, Acidithiobacillus ferrooxidans [Norton et al., 2008]. Однако распространение пути биосинтеза сахарозы и функциональная роль дисахарида в клетках метилотрофов и других протеобактерий не исследованы.

Априорно сахарозе отводится роль запасного соединения, накопление которого при различных стрессовых воздействиях указывает на защитную функцию, аналогичную таковой, показанной для трегалозы [Lunn, 2002]. Так, выживаемость клеток Escherichia coli, несущих ген сахарозофосфатсинтазы, возрастала в 104 раз [Billi et al., 2000]. Недавно показано, что сахароза выполняет функцию термопротектора у умеренно термофильного метанотрофа Methylocaldum szegediense O-12 [Медведкова и др., 2007]. Однако до сих пор гены и ферменты биосинтеза сахарозы не охарактеризованы ни у одного представителя протеобактерий. Пути метаболизма сахарозы изучены лишь у не синтезирующих сахарозу гетеротрофов, но использующих ее в качестве ростового субстрата - Zymomonas mobilis [Zembrzuski et al., 1992], Lactococcus lactis [Thompson et al., 1991] и E. сoli [Sigrell et al., 1998]. У этих бактерий гены, кодирующие ферменты метаболизма сахарозы, локализованы в кластерах, включающих также гены транспортных белков [Reid, Abratt, 2005]. В связи с вышеизложенным, представлялось актуальным исследовать гены и ферменты метаболизма сахарозы у протеобактерий на примере галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы – определение путей метаболизма сахарозы у модельного галотолерантного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z. Для достижения указанной цели были поставлены и решались следующие задачи:

1.  Идентификация генов, участвующих в метаболизме сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z.

2.  Очистка и характеристика рекомбинантных сахарозофосфатфосфатазы, амилосахаразы и фруктокиназы из Mm. alcaliphilum 20Z.

3.  Получение и фенотипическая характеристика мутантов по генам sps и ectBC.

4.  Изучение распространенности и филогенетический анализ генов метаболизма сахарозы у прокариот.

Научная новизна. Гены метаболизма сахарозы, организованные в трех- и четерыхгенные кластеры, обнаружены у различных групп микроорганизмов – протеобактерий (хемоавтотрофов и метилотрофных бактерий) и цианобактерий. Филогенетический анализ показал, что данные кластеры были приобретены путем горизонтального переноса генов. Установлено, что сахароза выполняет роль осмопротектора у Mm. alcaliphilum 20Z. Получен мутантный штамм, дефектный по генам биосинтеза эктоина ectB и ectC, который накапливает в 8 раз больше сахарозы по сравнению с исходным штаммом. Также получен мутант по гену sps, не способный синтезировать сахарозу, что подтверждает ключевую роль сахарозофосфатсинтазы в биосинтезе сахарозы у Mm. alcaliphilum 20Z. Впервые у протеобактерий очищены до электрофоретической гомогенности и охарактеризованы рекомбинантные сахарозофосфатфосфатаза, амилосахараза и фруктокиназа. Доказана котранскрипция генов ams и fruK, что подтверждает участие фруктокиназы в реутилизации фруктозы, образующейся при деградации эндогенной сахарозы.

Научно-практическое значение.

Благодаря высокой активности, стабильности и строгой специфичности к фруктозе препарат очищенной рекомбинантной фруктокиназы может использоваться в биохимических исследованиях в качестве сопрягающего фермента, а также для аналитического определения фруктозы. Мутант с инактивированным геном sps при выращивании на среде с высоким содержанием NaCl имеет больший, по сравнению с родительским штаммом, выход мультифункционального биопротектора эктоина, что может найти практическое применение.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на ежегодных отчетных конференциях ИБФМ РАН (2010-2012гг), на XV и XVI Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011-2012 гг), на Всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2011» (Тула, 2011 гг), на Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011-2012 гг).

Место проведения работы. Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ им. РАН в рамках темы «Экстремофильные и экстремотолерантные аэробные метилотрофы» (№ Госрегистрации 01.20.0403398). Работа была поддержана грантами РФФИ №10-04-01224-а, 11-04-97544-р_центр_а.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов.

Благодарности. Автор благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, способствовавшим выполнению данной диссертационной работы: к. б.н., с. н.с. , к. б.н. , к. б.н., н. с. , к. б.н., н. с. , к. т.н., с. н.с. Ежову признательность автор выражает своим научным руководителям ― д. б.н., в. н.с. и д. б.н., проф.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 113 стр. и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 212 ссылок, из них 8 на русском и 204 на английском языках, содержит 9 таблиц и 44 рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служила чистая культура облигатного метанотрофа Methylomicrobium alcaliphilum 20Z ВКМ B-2133 [Khmelenina et al., 1997]. Клетки выращивали на среде “2П” [Хмеленина и соавт., 1997], содержащей различные концентрации NaCl, в атмосфере метана и воздуха (1:1) или в присутствии 0,5 или 5% метанола. Перед засевом в среду вносили стерильный раствор 1 М NaHCO3 (5 мл на 100 мл среды). Штаммы Escherichia coli Top 10, S-17-1 и Rosetta (DE3) выращивали при 37оС на жидкой или агаризованной средах “LB”, добавляя, при необходимости, селективные антибиотики (канамицин – 50 мкг/мл, тетрациклин – 10 мкг/мл, хлорамфеникол – 25 мкг/мл, ампициллин – 100 мкг/мл).

Молекулярно-биологические методы. ДНК выделяли модифицированным методом [Marmur, 1961]. Выделение плазмид, рестрикцию, лигирование, получение компетентных клеток и их трансформацию проводили стандартными методами [Sambrook, Russell, 2001]. Тотальную РНК выделяли модифицированным методом [Chomczynski, Sacchi, 1987]. Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www. ncbi. nlm. nih. gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00 и VectorNTI®Advance v.9.0. Аминокислотные последовательности выравнивали посредством программы ClustalX (v1.62b) [Thompson et al., 1997]. Филогенетический анализ проводили, используя пакет программ MEGA4, модель Maximum Parsimony [Tamura et al., 2007].