Материалы по токсико–гигиенической оценке биологически активной добавки к пище эпоэкстрин (стр. 2 )

Физическую выносливость животных оценивали по длительности плавания. Интервал в 1 час между введением препарата и тестированием был выбран на основании имеющихся данных о том, что максимальное действие большинства антигипоксантов наблюдается через час после перорального введения.

Исследования антиоксидантной активности

Оценку антиоксидантной активности проводили для выбора эффективных доз субстанции Эпотек. Оценивали активность основного фермента – супероксидисмутазы (СОД) и малонового альдегида (МДА).

Определение активности СОД в плазме крови

Количественное определение активности СОД в плазме крови основного фермента окислительно востановительных реакций дыхательной цепи, проводили спектрофотометрически. Метод основан на использовании реакции окисления кверцетина аскорбиновой кислотой (5). Расчет проводили по формуле:

Δ1 Д406 – Δ 2 Д406 х 100 , где

Δ1 Д406

Δ1 Д406 – оптическая плотность за 20 минут в контроле без СОД;

Δ2 Д406 – оптическая плотность за 20 минут в опыте.

Определения МДА в плазме крови

Количественное определение МДА (основного активного продукта перекисного окисления липидов) в плазме крови проводили спектрофотометрически. Метод основан на использовании реакции комплексообразования продутов пероксидации с тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Окрашенный в розовый цвет комплекс продуктов пероксидации – МДА с ТБК имеет максимум поглощения при l = 535 нм. Для определения содержания предшественников МДА в сыворотке в пробы добавляли сернокислое железо. Это способствует разрушению комплексов – предшественников МДА и интенсификации окраски.

В первую пробу к 0,5 мл сыворотки крови, полученной после декапитации животного, добавляли 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты и 1 мл 0,6% раствора ТБК. Во вторую пробу – 0,5 мл сыворотки, 3 мл 1% раствора ортофосфорной кислоты, 1 мл 0,6% раствора ТБК и 0,1 мл раствора сернокислого железа. Пробы нагревали на кипящей бане в течение часа, охлаждали и добавляли в каждую по 4 мл n-бутанола. После тщательно перемешивания пробы центрифугировали при 3 тыс. об/мин в течение 5 мин.

Окрашенный в розовый цвет комплекс (продукты пероксидации с ТБК) образуется в слое n-бутанола (верхний слой пробы) и имеет максимум поглощения при l = 535 нм. Расчет содержания МДА проводили с учетом коэффициента его молярной экстинкции, который равен 0,156 х 106М-1/см-1, по формуле:

Содержание МДА = (Е х Р) / К,

где Е – экстинкция пробы;

К - коэффициент молярной экстинкции ;

Р – коэффициент разведения пробы.

Исследование подострой токсичности

Исследование подострой токсичности проводили для оценки степени безвредности субстанции Эпотек. Исследуемые вещества вводили крысам самцам массой –180 г перорально (зондом в желудок) в терапевтической для крыс дозе в виде раствора один раз в день ежедневно на протяжении 14 суток. Полученные результаты сравнивали с результатами, регистрируемыми у животных, получавших растворитель (воду очищенную), используемый для приготовления раствора, и у интактных животных. Каждая группа состояла из 10 крыс.

Оценивали общее состояние животных, состояние волосяного покрова, слизистых оболочек, массу тела. Исследовали функциональное состояние сердечно-сосудистой системы, нервной, мочевыделительной систем, морфологические показатели крови. По окончании эксперимента животных умервщляли для проведения патоморфологических исследований.

Общее состояние подопытных животных, состояние их волосяного покрова и слизистых на протяжении всего эксперимента не отличалось существенно от показателей у интактных животных и крыс, получавших воду очищенную.

Оценка динамики массы тела крыс представляет собой объективный показатель, часто используемый для интегральной характеристики общетоксического действия БАД и лекарственных средств. Крыс взвешивали (утром до момента кормления) ежедневно в течение всего периода введения Эпотека.

Влияние Эпотека на функции сердечно-сосудистой системы оценивали по результатом электрокардиографического исследования путем регистрации электрокардиограммы (ЭКГ) у крыс, снятой во втором стандартном отведении на электрокардиографе «Heart Mirror 3» (Венгрия). Рассчитывали следующие показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), величину зубцов R и S, интервалов PQ, QRS и QRST.

Влияние Эпотека на процессы образования и выделения мочи оценивали стандартными методами. Животных на сутки высаживали в специальные собирательные клетки. Устройство клетки позволяло собирать суточную мочу. Измеряли суточный диурез, плотность мочи, кислотность, наличие уробилиногена, билирубина, кетонов, глюкозы и белка.

Влияние Эпотека на состав форменных элементов крови оценивали стандартными методами. Количество гемоглобина определяли с помощью гемометра Сали. Подсчет лейкоцитарной формулы проводили на мазках крови, взятой из хвостовой вены крысы, окрашенных азур-эозином по Романовскому-Гимза. Определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов, время свертывания. Измерения проводили до начала эксперимента (исходные данные) и через 2 недели после начала введения Эпотека.

По окончании эксперимента крыс из контрольной группы и животных, получавших Эпотек декапитировали. Состояние внутренних органов оценивали визуально при аутопсии, измеряли массу органов и рассчитывали удельные значения этих показателей, выполняли гистологическое исследование случайным образом отобранных образцов тканей крыс. Для гистологических исследований вырезали небольшие участки тканей (толщина не более 5-10 мм), так чтобы вся структура органа попала в срез. Взятый материал этикетировали и помещали в 15 % водный раствор формалина. Далее объекты промывали, проводили через спирты возрастающей концентрации и заливали в парафин. Готовили гистологические срезы тканей с помощью микротома. Препараты окрашивали гематоксилином-эозином и исследовали с помощью светового микроскопа «Биолам».

Оценка кумулятивной активности (подострой токсичности по тесту Лима)

Кумулятивную активность определяли по тесту Лима (4, 6). Эта методика позволяет оценить кумулятивные свойства веществ. В опыте длительностью 24 ± 4 дня учитывали гибель животных при ежедневном энтеральном введении вещества в начальной дозе, равной 1/10 ЛД50, нарастающей в каждые последующие 4 дня в полтора раза по сравнению с предыдущей дозой. Полученные результаты позволяют рассчитать индекс кумуляции как отношение ЛД50 при однократном введении вещества к ЛД50 при кратном введении. Для этой цели используют методы, основанные на учете гибели животных при повторном введении фармакологического вещества (1). Если расчетный коэффициент меньше или близок к единице, то тестируемое вещество обладает кумулятивными свойствами. Чем больше полученный коэффициент, тем выше вероятность его кумуляции.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ Субстанции ЭПОТЕК

2.1. Результаты оценки острой токсичности

Острую токсичность субстанции Эпотек оценивали на белых беспородных мышах самцах массой г. Использовали 10 групп тест-объектов, по 10 животных в каждой. Субстанции вводили в диапазоне доз от 100 мг/кг до 3000 мг/кг. Наблюдение за животными осуществляли в течение 14 дней. ЛД50 рассчитывали по методу Миллера-Тейнтера. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Результаты определения средних смертельных доз субстанции Эпотек

Препарат	Путь введния	ЛД 16 М±м, мг/кг	ЛД50 М±м, мг/кг	ЛД84 М±м, мг/кг
Гипоксен	П/о	215,0	630,0±41,0	986,7	Р>0,05
Эпотек	В/бр	425,0	461,1+26,0	500,0	Р<0,05
Эпотек	П/о	2150,0	2360±37,1	2750,0	Р<0,05

В результате исследований установлено, что пищевой антиоксидант Эпотек, прелагаемый для использования в БАД является не токсичным соединением, относится к IV классу токсичности.

2.2. Результаты исследования антигипоксической субстанции Эпотек

Антигипоксическую активность исследовали на основных моделях гипоксических состояний: острой гипоксической гипобарической гипоксии (ОГБГ), острой гистотоксической гипоксии (ОГТГ), острой гемической гипоксии (ОГГ).

Острая гипобарическая гипоксия

На модели ОГБГ субстанцию Эпотек вводили перорально за 1 час до эксперимента в диапазоне доз: 1,6 мг/кг(1/1000 ЛД50); 3,2 мг/кг(1/500 ЛД50); 16 мг/кг(1/100 ЛД50); 32 мг/кг(1/50 ЛД50); 80 мг/кг(1/20 ЛД50); 160 мг/кг(1/10 ЛД50)). Препарат сравнения Гипоксен вводили в дозе 31,5 мг/кг (1/20 ЛД50). Контрольная группа животных получала перорально воду очищенную (5 мл/кг). Результаты опытов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Влияние субстанции Эпотек на переносимость мышами самцами ОГБГ (n= 20 в группе, пероральное введение)

№	Препарат	Доза, мг/кг	Длительность жизни	Прирост длительности жизни, %	Выживаемость %
1.	Контроль	5 мл/кг	3,88±0,27	___	0
2.	Гипоксен	31,5	10,80±0,76	178,3	40
3.	Эпотек	1,6	19,50±1,34	402,7	40
4.	Эпотек	3,2	15,89±1,11	309,5	20
5.	Эпотек	16	10,95±0,67	182,1	0
6.	Эпотек	32	15,59±1,09	301,8	60
7.	Эпотек	80	14,66±1,03	277,8	60
8.	Эпотек	160	9,50±0,67	144,8	40

Установлено, что препарат сравнения Гипоксен обеспечивает выживаемость 40% экспериментальных животных, при этом прирост длительности их жизни по сравнению с контролем составляет 178,3%.