Изучение связи мутаций митохондриального генома с атеросклеротическим поражением коронарных и сонных артерий (стр. 2 )

Генетическое исследование.

Для данного клинического исследования было выбрано 4 мутации митохондриального генома G13513A, G14846A, C3256Т и G12315A, для которых повышенный уровень гетероплазмии был связан с атеросклеротическим поражением по данным аутопсии [Sazonova M. et al., 2009].

Для исследования мутаций митохондриальногогенома кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат в качестве антикоагулянта. Кровь замораживали и хранили при -20оСдо проведения анализа.

Выделение геномной ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили методом фенол-хлороформной экстракции с использованием протеиназы К. Измерение концентрации ДНК проводили нанофотометром IMPLEN, GmbH, Германия. Далее разводили ДНК водой mQ (18,2) до концентрации 30 нг/мкл. Хранили ДНК при температуре – 20оС.

С целью амплификации короткоцепочечных участков мтДНК проводилась полимеразная цепная реакция (ПЦР) в амплификаторе РТС-200 (MJ Research, США). Для проведения ПЦР использовали раствор ДНК с концентрацией 30 нг/мкл и праймеры (таблица 1) с концентрацией 10 пмоль/мкл (, Москва). В состав реакционной смеси объемом 40 мкл входили: матричная ДНК 4 мкл, праймер F 2,7 мкл, праймер R 2,7 мкл, Taq-полимераза, 5 ед/мкл (, Москва) - 1,33 мкл, смесь дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: 2 mM аденозилтрифосфата, 2 mM тимидилтрифосфат, 2 mM гуанозилтрифосфата, 2 mM цитозилтрифосфата – 4 мкл, 70 mM Трис-HCl, pH 8,6, 16,6 mM (NH4)2SO4, MgCl2, 25 mM – 4 мкл (при необходимой концентрации 2,5 мМ) или 2,4 мкл (при необходимой концентрации 1,5 мМ), вода mQ 1,8 – до 40 мкл.

Таблица 1. Последовательность праймеров для полимеразной цепной реакции.

Мутация	Праймеры для ПЦР	C(Mg2+)
C3256T	bio-AGGACAAGAGAAATAAGGCC ACGTTGGGGCCTTTGCGTAG	2,5mM
G12315A	bio-CTCATGCCCCCATGTCTAA TTACTTTTATTTGGAGTTGCAC	2,5mM
G13513A	bio-AAGTCCTAGGAAAGTGACAGCGAGG CCTCACAGGTTTCTACTCCAAA	1,5mM
G14846A	bio-CATTATTCTCGCACGGACT GCTATAGTTGCAAGCAGGAG	1,5mM

Примечание. А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – гуанин, bio – биотинилированный праймер, C(Mg2+) – концентрация магния.

ПЦР проводили по схеме: денатурация ДНК при 94°С в течение 4 мин. Затем проводили 35 циклов амплификации, включающей в себя денатурацию ДНК (94°С/30 секунд), отжиг праймеров (56°С/30 секунд для C3256T, G13513A, G14846A и 50°С/30 секунд для G12315A) и элонгацию (синтез второй цепи) 72°С/1 мин. По окончании 35 циклов осуществляли заключительную элонгацию 72°С/7 мин. Детекцию продуктов ПЦР - амплификаты проводили с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле.

Пиросеквенирование.

Далее ПЦР амплификаты были пиросеквенированы для детекции нуклеотидной последовательности и определения уровня гетероплазмии исследуемых мутаций с помощью соответствующих праймеров («Синтол», Москва, РФ) (таблица 2). Пиросеквенирование проводили в автоматическом 96-луночном анализаторе PSQ96MA (PyrosequencingAB, Швеция) по методике, рекомендованной производителем.

Таблица 2. Праймеры для проведения пиросеквенирования.

Мутация	Сиквенсовый праймер
C3256T	AAGAAGAGGAATTGA
G12315A	TTTGGAGTTGCAC
G13513A	AGGTTTCTACTCCAA
G14846A	GCGCCAAGGAGTGA

Примечание.А – аденин, С - цитозин, Т – тимин, G – гуанин.

Определение уровня гетероплазмии мутаций митохондриального генома.

Количественная оценка мутантного аллеля заключалась в расчете уровней гетероплазмии мутаций мтДНК с использованием высот пиков пирограммы в исследуемой области одноцепочечного ПЦР-фрагмента митохондриального генома. Формула для подсчёта процента гетероплазмии мутаций митохондриального генома была разработана и соавторами в лаборатории медицинской генетики НИИ кардиологии им. :P = (h-N) / (M-N) * 100%; где P – процент гетероплазмии, h – высота пика исследуемого нуклеотида, N – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% нормальных аллелей, M – высота пика исследуемого нуклеотида, соответствующая наличию в образце 100% мутантных аллелей[Sazonova M. et al., 2009].

Для каждой из мутации C3256T, G13513A, G14846A, G12315A на основании общей формулы была создана собственная формула. Расчет производился с помощью программы MicrosoftExel.

Коронарная ангиография выполнялась на аппарате Allura Xper FD-10 (Philips, Нидерланды) через феморальный, радиальный либо ульнарный доступ Автоматический количественный анализ ангиограмм проводился на цифровой системе “Xcelera” (Philips, Нидерланды). Оценка поражения коронарного русла проводилась на основе ангиографической симптоматологии по двум методикам: 1) с учетом числа пораженных магистральных артерий (1; 2; 3), имеющих сужение просвета более 50% по диаметру; 2) по суммарному индексу стенозов (индекс Gensini), учитывая степень уменьшения просвета 15 основных сегментов коронарных артерий (Рекомендации Американской Ассоциации Сердца, 1975). Одним баллом оцениваются сужение просвета артерии до 50% по диаметру; 2 - на 50 - 74%; 3 - на 75 - 99% и 4 - окклюзия сосуда. Сумма баллов, полученная при оценке поражения коронарного русла, представляет собой коронарный индекс стенозов для каждого больного.

Ультразвуковое дуплексное сканирование брахиоцефального ствола, правой и левой общих сонных артерий, внутренних и наружных сонных артерий, позвоночных и подключичных артерий проводилось по стандартной методике в В-режиме с цветовым допплеровским картированием потоков линейным датчиком 7 Мгц ультразвуковой системы «АСUSON 128 ХР 10», а также на аппарате Philips iU 22 и Philips Ewiser. У всех больных оценивали наличие атеросклеротических бляшек с оценкой степени стенозирования. Атеросклеротическая бляшка определялась как «фокальная» структура, выступающая в просвет артерии не менее, чем на 0,5 мм или на 50% от величины толщины интима-медиа прилегающих участков артерии, либо имеющая толщину, измеренную как расстояние между линиями раздела «медиа - адвентиция» и «просвет артерия - интима» более 1,5 мм (по данным Международного консенсуса по ТИМ 2004-2006 годов [Touboul P. J. et al., 2007].

Статистический анализ данных.

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью пакета прикладных статистических программ STATISTICA (v.6.0). Вид распределения количественных признаков анализировали при помощи теста Колмогорова-Смирнова. При описании количественных показателей с нормальным распределением приводились среднее значение (М) и стандартное отклонение (SD), если распределение не соответствовало параметрическому, приводили медиану (Ме) и межквартильные интервалы (25-й процентиль; 75-й процентиль). Для качественных величин данные представляли какn(%).Для оценки значимости статистических различий по количественному признаку использовались параметрический (t критерий Стьюдента) и непараметрический (критерий Манн-Уитни) методы. Значимость различий качественных признаков в группах наблюдения оценивали при помощи непараметрического критерия c2 Пирсона, при малой встречаемости признака использовали точный тест Фишера. Для оценки связи мутаций митохондриального генома с факторами риска и атеросклерозом коронарных и сонных артерий использовался корреляционный анализ с использованием рангового критерия Спирмена. Для оценки диагностической значимости мутаций митохондриального генома были построены характеристические кривые. В качестве критерия диагностической значимости рассчитывали площадь под кривой. Уровень значимости принят при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

За период с 2010 по 2012гг в исследование включены 193 пациента (154 мужчин и 39 женщин) в возрасте от 33 до 78 лет (средний возраст 54,6±9,5 лет). Группы были сопоставимы по возрасту, артериальной гипертонии, ожирению, отягощенной наследственности по отцовской линии (таблица 3). В основной группе было больше мужчин, чем в контрольной группе. Мужчины с коронарным атеросклерозом были существенно старше. Средний возраст у обследованных женщин между группами не отличался. Лиц с отягощенным анамнезом по материнской линии было больше среди больных в основной группе: 26% против 13% в контрольной группе, p=0,05. В группе с коронарным атеросклерозом встречались существенно чаще лица с курением в анамнезе: 68% в сравнении с 24%, p<0,001. В основной группе 60% больных перенесли инфаркт миокарда, у половины было стентирование коронарных артерий, у 18% - операция аортокоронарного шунтирования в анамнезе.

Таблица 3.Клиническая характеристика групп обследованных больных

Показатель	Основная группа, n=130	Контрольная группа, n=63	p
Мужчины	116 (89%)	38 (60%)	<0,001
Женщины	14 (11%)	25 (40%)	<0,001
Возраст, лет	55,0±9,1	53,9±10,3	0,45
Возраст мужчин, лет	54,4±8,9	49,3±7,5	<0,001
Возраст женщин, лет	59,9±9,5	60,8±10,1	0,54
Артериальная гипертония	95 (73%)	45 (71%)	0,94
Курение	88 (68%)	15 (24%)	<0,001
Гиперлипидемия	124 (95%)	50 (78%)	<0,001
Отягощенная наследственность: - по отцовской линии - по материнской линии	22 (17%) 34 (26%)	9 (14%) 8 (13%)	0,80 0,05
Ожирение	37 (28%)	21 (33%)	0,59
Инфаркт миокарда в анамнезе	78 (60%)	0	-
Коронарное стентирование	69 (53%)	0	-
Аортокоронарное шунтирование	23 (18%)	0	-

Примечание.Данные представлены как n (%), М±SD.