Международный союз по охране новых сортов растений (стр. 5 )

4.  Изучение 40 сортов пшеницы показало, что все эти сорта, за исключением одной пары родственных линий, можно было отличить, используя 8 маркеров микросателлитов (коротких тандемных повторений, SSR). Микросателлиты – это высоко полиморфные, тандемно повторяемые последовательности ДНК с базовой повторяемой единицей (или базовой последовательностью) 2-8 пар оснований (например, GA, CTT и GATA). Полиморфизм, найденный в микросателлитах, является результатом изменений в количестве копий базовой повторяемой единицы. У различных видов культур, увеличение таких вариаций ("аллелей") показало существование многих микросателлитов у разных сортов, возникающих в результате этих различий в количестве копий. Микросателлиты могут быть проанализированы как последовательно-отмеченные места (STMS), которые требуют использования пар ДНК-праймеров (коротких последовательностей), которые обрамляют микросателлит. Использование этих пар праймеров в цепной реакции полимеразы (PCR) усиливает область микросателлита. Различные аллели местоположения микросателлита ("локусы") могут затем быть отделены и визуализированы с помощью микрофореза или другими аналитическими методами.

5.  Следует заметить, что маловероятно (но не невозможно), что эти микросателлитные последовательности связаны с существующими УПОВ признаками. Однако, они могут быть нанесены на карту, и их наследование может сопровождаться в кроссах. Выраженность аллелей, например, в качестве соединений на геле, не является результатом влияния окружающей среды или стадии развития растения.

6.  Все 8 SSRs известны, чтобы нанести их на карту в различные хромосомные местоположения в геноме пшеницы и могут быть достоверно и повторяемо исследованы.

7.  Была изучена однородность 40 сортов в отношении локусов 8 SSR. Предварительный анализ показал, что однородность объединяющихся конфигураций всех растений в пределах сорта зависит от сорта и молекулярного маркера. В 15 из 40 сортов, не было найдено никакой разницы объединенных конфигураций 48 растений по любому из 8 SSRs. У еще 8 сортов было только одно различие в 48 растениях, в то время как у 2 сортов было отдельное растение с различными аллелями в 2 локусах. Этот анализ должен все же быть завершен, но, в конечном счете, он обеспечит определение однородности существующих охраняемых сортов по этим локусам, то есть, что в настоящее время достигается селекционерами пшеницы без каких-либо определенных усилий по установке чистоты сорта по этим признакам.

8. Предлагается следующая схема:

Шаг 1: Сорт-кандидат принимается компетентным органом по испытаниям. Затем он профилируется, используя согласованный и фиксированный набор 8 SSR маркеров.

Шаг 2: Исходная информация по ДНК профилю используется для определения того, явно ли отличим кандидат от общеизвестных сортов, и/или определения того, от каких сортов он – не явно отличим (в соответствии с ниже согласованным основанием).

Шаг 3: Если сорт-кандидат может явно быть отличим, используя этот набор маркеров, то он считается отличимым. Одно основание отличия могло быть возникновением различной аллели в одном местоположении маркера, по которому сорт-кандидат и сорт-эталон достаточно однородны. Однако, возможно, что можно применять более строгое требование (например, различные аллели более, чем в одном локусе, то есть условие наличия различий больше, чем в одном маркере) ("Отличимость плюс"), хотя это, конечно, уменьшило бы различительную силу маркеров.

Шаг 4: Стандарт однородности будет базироваться на том, что в настоящее время применяется к охраняемым сортам (см. 7 выше), который, в свою очередь, определит количество экземпляров, которые должны быть проанализированы. Если берется подход "Отличимость плюс", то критерии однородности должны быть тоже скорректированы. Растения, для которых различие было меньше, чем то, что обычно применяется при установлении отличимости, не будут расцениваться в качестве вариантов в целях оценки однородности.

Шаг 5: Кандидаты, не являющиеся достаточно однородными по любым 8 маркерам, не будут впоследствии испытываться, и не будут охраняться.

Шаг 6: Если кандидат не может быть явно отличим от всех общеизвестных сортов, то впоследствии сорта, от которых нет никакого отличия (в соответствии с согласованными критериями) отбираются для включения в полевое испытание.

Шаг 7: Процесс повторяется для всех кандидатов, а полевые испытания тогда планируются таким образом, чтобы похожие сорта выращивались близко друг к другу, то есть сравнения могут быть с готовностью сделаны между наиболее похожими группами кандидатов/эталонных сортов. Планирование могло также использовать информацию, представляемую селекционером в Технической анкете (TQ ).

Шаг 8: Все кандидаты высеваются в полевых испытаниях для проверки однородности и стабильности соответствующих, не молекулярных признаков.

Шаг 9: Признаки, регистрируемые в полевых испытаниях, включали бы уменьшенный набор зарегистрированных в настоящее время, на основании, например, анализа их отличительной силы, либо по отсутствию их экологического взаимодействия, или по их полезности в описательных целях (включая сертификацию).

Шаг 10: Если установление отличия - все еще затруднено, то можно было бы использовать дополнительные признаки в специальном испытании. Такие признаки должны были бы соответствовать тем же самым критериям, что по существующим признакам.

Шаг 11: Описание сорта состояло бы из профиля ДНК и из регистрируемых признаков полевых испытаний.

Предположения (допуски), которые должны быть сделаны в этом примере

9. Следующие предположения (допуски) делаются:

(a)  ООС экспертиза

Предполагается, что стандарты для использования маркеров SSR согласовывались бы (см. 7 выше, плюс 8, шаги 2-4). Стандарты однородности и стабильности по данным этого маркера определялись бы как в параграфе 7 выше, на базе того, что в настоящее время достижимо. Те же самые стандарты, существующие на данный момент, применялись бы в полевых испытаниях, с применяемыми в настоящее время критериями однородности и стабильности.

(b)  Надежность методов

Предполагается, что маркеры SSR отвечают всем обычным требованиям какого-либо признака, который будет применяться в ООС экспертизе (см. "Общее введение"), включая необходимость быть достаточно последовательным и повторяемым.

(c)  Набор маркеров

Был бы 'установлен' набор из 8 SSR маркеров, используемых для создания базы данных и оценки кандидатов. Однако, должны быть доступны в течение долгого времени улучшенные и/или дополнительные маркеры, оригинальный набор маркеров мог быть увеличен, или наоборот, менее полезные маркеры заменены. Любые такие дополнительные маркеры должны были бы проверяться, так же, как оригинальный набор из восьми маркеров.

(d)  Однородность

Предполагается, что ситуация, найденная в исходном исследовании 40 сортов, особенно относительно однородности существующих сортов, будет широко показательна для всех существующих охраняемых сортов.

(e)  База данных профилей ДНК

Предполагается, что соответствующая база данных может быть создана и поддерживаться, включая профили ДНК общеизвестных сортов, возможно - также подразделена, например, в соответствии с происхождением сорта и/или агро-климатическими регионами.

Потенциальное влияние

11.  Существенное положительное влияние на силу и качество охраны было бы потенциалом в демонстрации намного более всесторонней коллекции сортов-эталонов. В настоящее время хорошо известно, что сортовые коллекции значительно различаются в своем охвате общеизвестных сортов, и что экологические взаимодействия со многими морфологическими признаками ставят под угрозу эффективность опубликованных описаний (см. документ TWA/30/16). Этот пример предлагает возможность рассмотреть обе эти проблемы.

12.  Возможно, что предложенная система может позволить, чтобы сорта, которые должны декларироваться как D(отличимые), U(однородные) и S(стабильные) испытывались один год.

13.  Один случай, при котором у этого примера могло быть потенциальное негативное влияние на силу охраны, состоит в том, что сорта, которые не считались отличимыми, используя традиционные признаки, будут считаться отличимыми, используя данный подход. Это могло оцениваться путем параллельного осуществления прогона по согласованному числу лет (или, где, если возможно, могло быть сделано ретроспективно).

14.  Если селекционер выводит новый сорт путем изменения только молекулярного профиля маркера, это могло стать очевидным из описания сорта (и могло тогда, по-видимому, вызвать исследование возможного статуса EDV).

15.  Риск получения нового сорта методом отбора из существующего сорта, мог быть минимизирован требованием различий более, чем в одном SSR локусе, для того, чтобы сорт считался отличимым (см. 8, шаги 3 и 4 выше). В любом случае, риск с этим примером не больше чем тот, что в настоящее время существует. Этот пример сохраняет связь между размером различий, требуемых для установления стандартов явной отличимости и однородности. Поэтому, было бы бесполезно отбирать и очищать части достаточно однородного сорта, потому что такая коллекция растений не будет явно отличимой от оригинального сорта.

Отличимы: (определение, кот. согласовывается) проверить U маркеров (Никакие частности не согласовываются)

Приложение 4 следует

Не отличимый: отсеивается

Отличимый: пропускается

Не достаточно U: отсеивается

Достаточно U – сорт D Никаких испытаний на D не требуется: пропускается

Не отличимы Определить наиболее похожий(е) сорт(а) Вырастить в полевом испытании с наиболее похожим(и) сортом(и); (+ данные TQ) Зарегистрировать согласованные признаки (как для ядов из колосьев)

Добавляются данные в базу данных SSR

Анализ семян/растений с 8 SSRs

U и S - пропускаются

Не U и S - отсеиваются

Выращиваются ряды из колосьев на U и S Регистрируются согласованные признаки (которые должны быть согласованы)

Сорта-кандидаты