Работа на тему: «Вирус гриппа» (стр. 3 )

Таким образом, суммарная концентрация вируса, участвующего в процессе эндоцитоза описывается уравнением:

Рассмотрим поведение функции (2.17) во времени. С увеличением времени взаимодействия вирусных частиц с клетками суспензии, количество комплексов вирус-клетка постепенно увеличивается с нуля до некоторого максимального значения [VR]m (до момента времени tm – время насыщения клеточных рецепторов) после чего количество вируса на поверхности клеток начнет уменьшаться, а количество вируса внутри клеток расти. Т. е если клетки физически способны вместить в себе все вирусные частицы из суспензии, то через достаточно большой временной промежуток весь вирус уйдет внутрь клетки, что не противоречит физической сути процесса, поскольку количество вируса уменьшается и, все меньше вирусных частиц может сесть на клетку, поэтому и наступает такой момент времени, когда концентрация вируса на поверхности клетки достигает своего максимума (с последующим спадом).

Найдем время tm:

Поскольку в этой точке функция (2.17) достигает своего максимума, то ее производная равна нулю:

Это характерное время (время насыщения) зависит от всех кинетических констант, и его можно использовать как еще один параметр для оценки исследуемых свойств системы - рецепторной специфичности. Также видно, что при отсутствии эндоцитоза (kin=0) это время насыщения бесконечно, что означает насыщение клеточных рецепторов вирусом и установление равновесия.

Конкурентная модель

(связывание вируса с рецепторами клетки и конкурентом (аналогом клеточного рецептора – белком фетуином))

Добавление в систему вирус - клетка дополнительных «претендентов» на связывание с вирусными рецепторами приводит к добавлению к системе (2.5) дополнительного уравнения, отвечающего за образование нового комплекса вирус-конкурент.

где [V]- концентрация свободного вируса в суспензии

[R] – концентрация свободных рецепторов на поверхности клеток

[VR]s, in –концентрация вируса на поверхности и внутри клетки

[L] – концентрация конкурента (молекул фетуина)

[VL] – комплекс вирус-конкурент (молекулы фетуина)

k+, k - – кинетические константы связывания вируса гриппа с клеткой: ассоциации и диссоциации соответственно

k+1, k-1 – кинетические константы связывания вируса гриппа с блокатором: ассоциации и диссоциации соответственно

kin –константа проникновения вируса внутрь клетки (константа эндоцитоза)

Приближения:

[L]>>[VR]S [L]>>[V], подставляем в систему (2.21), получаем:

Решение данной системы достаточно громоздко и сложноразрешимо в рамках наших допущений ввиду наличия большого количества промежуточных величин. Однако, анализируя данную систему, можно полагать, что наличие блокатора сопровождается некоторыми изменениями решения (2.17). Снижение концентрации вируса на поверхности клетки будет сопровождаться сдвигом, а, следовательно, и уменьшением пика [VR]m, таким образом, уменьшится концентрация вируса и внутри клетки. Значит, наличие блокатора может спровоцировать остановку, или, вероятнее, торможение процесса эндоцитоза.

Материалы и методы

Материалы

Вирус. Вирус гриппа, штамм A/Aichi/2/68, получен из Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, г. Москва, прошедший пять пассажей на лёгких мышей и один-два пассажа на культуре клеток MDCK. Гемагглютинирующая активность материала составляла 256 ед. Очистка и концентрирование вируса с помощью фильтра-концентратора Vivaspin 20 (300кДа) и центрифуги (4500 об/мин., 30 мин., t=4єC) Растворы для реакций

Раствор фетуина 0.1%-ный в фосфатном буферном растворе Стандартный фосфатный буферный раствор (PBS – Phosphate Buffer Solution) в физиологическом растворе, поддерживающий рН 7,2 Питательная среда RPMI 1640. Субстрат:{9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl. H2O2+6mkg. OFD} Флуоресцентный краситель LysoSensor Blue DND-167 Измерение параметра эффективности ингибитора (IC50) методом ФОЕ

Метод ингибирования фокусообразующих единиц

В работе для измерения концентрации вирусных частиц использована методика связывания вируса с молекулами фетуина. Суть её заключается в следующем. Оболочечный белок вируса гриппа, гемагглютинин, имеет сродство к определённым клеточным рецепторам, сиаловым кислотам. Молекулы фетуина – это модель клеточного рецептора, к которому вирус также имеет специфичное сродство через взаимодействие с сиаловыми кислотами. Конъюгированный с ферментом фетуин при связывании с вирусными частицами позволяет количественно измерить концентрацию вирусных частиц по величине концентрации продуктов ферментативной реакции. По количеству вирионов на поверхности напрямую определяется концентрация вирусных частиц.

Алгоритм определения параметра IC50 методом фокусообразующих единиц (ФОЕ)

Готовится раствор фетуина (1мг/1мл PBS). Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды (ИГЛА ДМЕМ,100 ед/мл пенецилина,100 мкг/мл стрептомицина, 300 мкг/мл L-глютамин, 10 мкг/мл ДЕАЕ-декстрана (Sigma), 5 мкг/мл трипсина TPCK) Готовятся серийные двукратные разведений блокатора фетуин, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора. Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубируется 30 мин при температуре 35оC. Удаляется ростовая среда из лунок планшета с монослоем клеток MDCK; монослой двукратно промывается средой для разведения вируса. Перенос (после окончания инкубации) из планшета с разведениями сывороток по 100 мкл в соответствующие лунки планшета с монослоем клеток Инкубируется при 35 оC в течение 18 часов в CO2 атмосфере. Удаляется из планшета содержимое (без промывки), добавляется по 50 мкл охлажденного ацетона (80%) в каждую лунку; на 15 минут при комнатной температуре Промываюется планшет фосфатно-буферным раствором (ФБР) 2-3 раза по 200 мкл на лунку Готовится разведение 1:2000 моноклональных антител к белку NP вируса гриппа А (CDC, Atlanta, Lot 03-0325L) в ФБР, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина и 0.1% Твин 20, и по 50 мкл добавляется в каждую лунку. 35оC на 60 минут. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку; удаляются лишние капли. Добавляется по 50 мкл на лунку раствора конъюгированных биотином антител кролика к иммуноглобулинам мыши (1/3000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку. Добавляется 50 мкл на лунку раствора конъюгированного пероксидазой хрена стрептавидина (1/2000 в ФБР); на 30 минут при 35 оC. Клетки промываются дистиллированной водой 2-3 раза по 200 мкл на лунку. Добавляется в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата (9ml. H2O +1ml. NaAc(0,5M) +60 mkl. H2O2+6mkg. OFD); при комнатной температуре в темноте 30 минут. Планшет промывается под краном. В каждую лунку добавляется по 50 мкл дистиллированной воды. Подсчитываются под микроскопом образовавшиеся фокусные единицы (зараженные клетки) в каждой отдельной лунке.

Данные о количестве зараженных клеток позволяют построить зависимость числа инфицирования клеток от концентрации блокатора фетуин. С помощью полученной зависимости, определяется параметр IC50 – концентрация ингибитора, при которой число образовавшихся комплексов равно половине от числа комплексов в случае отсутствия конкурента ([IC50]=моль/мл) вещества.

Расчет IC50 проводится методом пробит-анализа на основе полученных экспериментальных зависимостей «Доза ингибитора - ингибирующий эффект»

Данный параметр определяется с точностью, соответствующей погрешности пипеток используемых при титровании вирусной суспензии и статистической погрешности, определяемой при подсчете фокусов в монослое клеток.

Метод иммуноферметного анализа

Существуют различные экспериментальные методы исследования взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне, которые позволяют исследовать структуру и динамику этого взаимодействия.

В настоящее время самым распространенным методом является метод иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). Метод принципиально сходен с РИА, но меткой является молекула фермента, ковалентно связанная с одним из реагентов, а после разделения связанных и свободных реагентов проводится ферментативная реакция, дающая в результате окрашенный продукт, в условиях избытка субстрата. Реакция останавливается (или самотормозится), и количество наработанного продукта измеряется спектрофотометрическим способом. Метод характеризуется высокой чувствительностью.

Наибольшее значение ИФА имеет для определения наличия антител или антигенов в крови или других биологических жидкостях в различных тест-системах. Наиболее распространенными объектами являются белки, их мембранные фракции, вирусные частицы, реже фиксированные клетки. Проведение кинетических исследований затруднено в силу большого количества стадий, необходимых по протоколу, после процесса непосредственного связывания антигена и антитела.

Особенностью методического подхода, реализованного в работе [41], является определение кинетических закономерностей вирус-клеточного взаимодействия вириона с модельными клеточными рецепторами (фетуин) и живыми чувствительными к вирусу гриппа клетками (MDCK).

Метод флуоресцентной детекции

LysoSensor blue DND-167 Для наблюдения изменений, происходящих с клетками на первых стадиях проникновения вирусной частицы в клетку (Рисунок 4) применяли лизосенсор – рН-зависимый флюоресцентный маркер DND-167, интенсивность флюоресценции которого увеличивается при понижении рН в месте связывания вируса с клеточными рецепторами и внутри эндосомы от нормального значения до рН ~5 (Рисунок 5).