Работа на тему: «Вирус гриппа» (стр. 6 )

Результаты

В нашей работе была получена степень эффективности ингибитора (противовирусного препарата) методами ФОЕ (стандартный вирусологический метод) и флуоресцентной детекции. Обработка результатов ингибирования фокусов и интенсивности флуоресценции системой пробит - анализа позволяет находить необходимый параметр IC50, а также сравнивать различные методики для его нахождения.

На рисунке 19 представлены полученные IC50 для ингибитора фетуин методами ФОЕ и флуоресцентной детекции, которые не отличаются на уровне значимости 5%. Данные о степени эффективности ингибитора приведены ниже в таблице 3.

Также при решении обратной задачи метода флуоресцентной детекции были получены кинетические параметры системы «вирус - клетка», полученные для данного вируса Aichi и клеток линии MDCK методом ИФА. Данные о кинетических константах также приведены ниже в таблице 3.

Таблица 3 Кинетические параметры, полученные различными методами (*[40])

метод	T0C	k+, М-1·s-1	k-, М-1·s-1	kin, М-1·s-1	tнасыщ, min	IC50, М
ФОЕ	37	-	-	-	-
Флуоресц. детекции	37	(2,5±0,2)·108	(6,6±0,5)·10-4	(5±0,3)·10-3	2,6±0,4
ИФА	32	(1±0,1)·105	(3±0,4)·10-4	(2±0,2)·10-4	30±2	-
ИФА	10	(3,3±0,3)·104	(1±0,1)·10-4	0	-	-
(A/PR8/34)+ MDCK*	20	-	-	2,6·10-4	-	-

Полученные значения, приведенные в таблице 3 хорошо согласуются между собой: при увеличении температуры возрастают k+ и kin (за счет повышения пластичности мембраны клетки (можно сказать ее плавления), что приводит большей гибкости и в конечном итоге к более быстрому (за счет этого с ростом температуры уменьшается tнасыщ) и более крепкому взаимодействию нескольких рецепторов с одним вирионом).

k - остается практически неизменным.

kin возрастает резко: от отсутствия эндоцитоза при 100С до резкого увеличения на порядок при 370С (в сравнении с 320С).

Однако, существенные различия между параметрами, полученными данными методами можно объяснить тем, что во всех методиках, кроме флуоресцентной детекции (ФОЕ, ИФА, [40]) использовался клеточный монослой, тогда как в методе флуоресцентной детекции для насыщения системы клеточными рецепторами, использовалась клеточная суспензия, что объясняет самую быструю адсорбцию вируса на клетку.

Таблица 4 Сравнительная характеристика методов ФОЕ, ИФА и флуоресцентной детекции на основании полученных результатов

метод	IC50	[VR]in(t)	[VR]s(t)	k±	tнасыщ	kd(Vi+ing)	kd(Vi+cells)	Рабочее время
ФОЕ	+	-	-	-	-	-	-	~24ч.
ИФА	-	-	+	+	+	+	+	~1,5ч.
Фл. детекции	+	+	+	+	+	+	+	~30м.

В таблице 4 приведена сравнительная характеристика методов, рассматривающихся в данной работе. Разработанный нами метод (флуоресцентной детекции) позволяет получить данные о системе в любой момент времени, что является несомненным преимуществом над другими методиками. Методом флуоресцентной детекции можно определить параметр эффективности ингибитора IC50, концентрацию вируса не только на поверхности [VR]s(t), но и внутри клетки [VR]in(t), а также интересующие кинетические параметры системы «вирус – клетка». Время, затраченное на проведение эксперимента по которому определяются все необходимые параметры флуоресцентным методом ~ 30минут, что является наименьшим экспериментальным временем.

Заключение

Для исследования вирус - клеточного взаимодействия разработан новый метод флуоресцентной детекции, основанный на измерении степени активации клетки (изменение внутреклеточного pH) в ходе процессов связывания и проникновения вируса в клетку. Экспериментальные исследования показали, что ингибирование интенсивности флюоресценциии коррелирует с ингибированием инфекционности вируса гриппа, поэтому данный метод позволяет определять степень эффективности вирусного ингибитора (противовирусного препарата), что было подтверждено с помощью общепризнанного метода фокусообразующих единиц (ФОЕ). Используя метод флуоресцентной детекции были получены кинетические параметры системы «вирус - клетка», которые не только не противоречат ранее известным, но и совпадают в пределах разумных возможных допущений (что подтверждается данными полученными методами иммуноферметного анализа (ИФА), а также литературными данными [40])

Немаловажен и тот факт, что часто при работе с биологическими системами, наименьшее время проведения эксперимента говорит о лучшей точности определяемых параметров. Именно поэтому метод флуоресцентной детекции можно рассматривать как один из наиболее современных и точных методов современной биофизики.

Разработана кинетическая модель взаимодействия вируса с клеткой, учитывающая процесс эндоцитоза, которая достаточно хорошо описывает экспериментально наблюдаемый процесс активации лизо-сенсора DND-167 в результате рецептор - обусловленного эндоцитоза. Данная кинетическая модель позволяет решать обратную задачу флуоресцентной детекции и находить необходимые кинетические параметры системы, а также прогнозировать поведение штамма вируса на первых этапах процесса эндоцитоза (связывание и проникновение).

Итоги работы:

Разработан новый метод определения эффективности ингибитора и кинетических параметров системы «вирус-клетка» с применением флуоресцентной детекции Построена теоретическая модель процесса вирус-клеточного взаимодействия

Выводы:

Полученные IC50 с помощью стандартного вирусологического и нового флуоресцентного методов не отличаются на уровне значимости 5% Теоретическая модель, описывающая эндоцитоз, применима для расчетов кинетических параметров системы «вирус - клетка» Разработанная методика измерения степени активации методом флуоресцентной детекции в различные моменты времени позволяет судить о стадиях процесса эндоцитоза, в которых находится система «вирус-клетка».

Список литературы

Compans R. W., Choppin P. W. Reproduction of prehensive virology, N. Y., p.179-252, 1975. Naim H. Y., Roth M. G. Basis for the selective incorporation of glycoproteins into the influenza virus envelope. Virology, p.4831-4841, 1993. Heggeness M. H., Smith P. R., Ulmanen I. Studies of the helical nucleocapsid of influenza virus. Virology, p.466-470, 1982. Lamb R. A., Krug R. M. Orthomyxoviridae : the viruses and their replication. In: Fields Virology. Edited by B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley. Philadelphia: Lippincott-Raven, p.1353-1395, pans R. W., Content J., Duesberg P. H. Structure of the ribonucleoprotein of influenza virus. Virology, p.795 – 800, 1972. Wu W. W. H., Weaver L. L., Pante N. Ultrastructural Analysis of the Nuclear Localization Sequences on Influenza A Ribonucleoprotein Complexes. Molecular Biology, p. 910-916, 2007. Baudin F., Bach C., Cusack S. et al. Structure of influenza virus RNP: I. Influenza virus nucleoprotein melts secondary structure in panhandle RNA and exposes the bases to the solvent. EMBO, p. 3158-3165, 1994. Elleman C. J., Barclay W. S. The M1 matrix protein controls the filamentous phenotype of influenza A virus. Virology, p.144-153, 2004. Horimoto T, Kawaoka Y. Influenza: lessons from past pandemics, warnings from current incidents. Natl. Rev. Microbiology, p.591-600, 2005. Baigent S. J., McCauley J. W. Influenza type A in humans, mammals and birds: determinants of virus virulence, host-range and interspecies transmission. BioEssays, p.657-671, 2003. Matrosovich M. N., Klenk H.-D., Kawaoka Y. Receptor specificity, host range and pathogenicity of influenza viruses. Influenza Virology: Current Topics. Kawaoka Y. (Ed.). Caister Academic Press, Wymondham, England, p.95-137, 2006. С. Лурия, Дж. Дарнелл, Д. Балтимор, Э. Кэмпбелл, Общая вирусология, Мир, 1981. McClintock P. R., Billups L. C., Notkins A. L., Receptors for encephalomyocarditis virus on murine and human cells, Virology, 106, 261 – 227, 1980. Korte T., Herrmann A., pH-Dependent binding of the fluorophore bis-ANS to influenza virus reflects the conformational change of hemagglutinin. European Biophysics Journal, p.105-113, 1994. S. Patterson, J. S. Oxford. Early interaction between animal viruses and the host cell: relevance to viral vaccines. Vaccine, p.79-90, 1986. Blumenthal R., Bali-Puri Anu, Walter A., Covell D., Eidelman Ofer. pH-dependent Fusion of Vesicular Stomatitis Virus with Vero Cells. Biological Chemistry, p.13614-13619, 1986. Daniel L. Floyd, Justin R. Ragains, John J. Skehel, Stephen C. Harrison, Antoine M. van Oijen. Single-particle kinetics of influenza virus. PNAS, p.15382-15387, 2008. , , . Моделирование неоднородного распределения и колебаний трансмембранного потенциала и pH вблизи внешней стороны мембраны клетки водоросли Chara coralline. Биофизика, с. 492-499, 2005. Matrosovich M. N., Mochalova L. V., V. P.Marinina, N. E.Byramova, N. V.Bovin. Synthetic polymeric sialoside inhibitors of influenza virus receptor-binding activity. FEBS Lett., 209-211, 1990. M. N.Matrosovich, A. S.Gambaryan, A. B.Tuzikov, N. E.Byramova, L. V.Mochalova, A. A.Golbraikh, M. D.Shenderovich, J. Finne, N. V.Bovin. Probing of the receptor-binding sites of the H1 and H3 influenza A and influenza B virus hemagglutinins by synthetic and natural sialosides. Virology, p.111-121, 1993. A. S.Gambaryan, V. E.Piskarev, A. M.Sakharov, A. B.Tuzikov, N. V.Bovin, N. E.Nifant'ev, M. N.Matrosovich. H1, H3, and B human influenza virus recognition of sialyloligosaccharides. FEBS Lett., p.57-60, 1995. Melike Lakadamyali, Michael J. Rust, Xiaowei Zhuang. Endocytosis of influenza viruses. Microbes and infections, p.929-936, 2004. Boerries Brandenburg, Lily Y. Lee, Melike Lakadamyali, Michael J. Rust, Xiaowei Zhuang, James M. Hogle. Imaging Poliovirus Entry in Live Cells. PLOS Biology, p.1543-1555, 2007. Martin K., Helenius A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: the viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell, p.117-130, 1991. Whittaker G., Bui M., Helenius A. The role of nuclear import and export in influenza virus infection. Cell Biology, p.67-71 1996. Hess S. T., Kumar M., Verma A. Quantitative electron microscopy and fluorescence spectroscopy of the membrane distribution of influenza hemagglutinin. Cell Biology, p.965-976, 2005. Ali A., Avalos R. T., Ponimaskin E. Influenza Virus Assembly: Effect of Influenza Virus Glycoproteins on the Membrane Association of M1 Protein. Virology, p.8709-8719, 2000. Lohmeyer J., Talens L. T., Klenk H. D. Biosynthesis of the influenza virus envelope in abortive infection. Genetic Virology, p.73-88, 1979. Yasuda J., Bucher D. J., Ishihama A. Growth control of influenza A virus by M1 protein: analysis of transfectant viruses carrying chimeric M gene. J. Virology, p.8141-8146, 1994. Chen Chen, Xiaowei Zhuang. Epsin 1 is a cargo-specific adaptor for the clathrin-mediated endocytosis of the influenza virus. PNAS, p.11790-11795, 2008. Boerries Brandenburg, Xiaowei Zhuang. Virus trafficking – learning from single - virus tracking. Microbiology, p.197-208, 2007. Fernando Patolsky, Gengfeng Zheng, Oliver Hayden, Melike Lakadamyali, Xiaowei Zhuang. Electrical detection of single viruses. PNAS, p.14017- 14022, 2004. Michael J Rust, Melike Lakadamyali, Feng Zhang, Xiaowei Zhuang. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nature Structural and Molecular Biology, p.567-573, 2004. Tatsuya Sakai, Masanobu Ohuchi, Masaki Imai, Takafumi Mizuno, Kazunori Kawasaki, Kazumichi Kuroda, Shohei Yamashina. Dual Wavelength Imaging Allows Analysis of Membrane Fusion of Influenza virus inside cell. Virology, p.2013-2018, 2006. T. J.Wickham, R. R.Granados, H. A.Wood, D. A.Hammer, and M. L.Shuler. Biophys. J., Vol.58, p.1501-1516, 1990. Perelson A. S. DeLisiC., Wiegel F. W. eds., Marcel Dekker. Some mathematical models of receptor clustering by multivalent ligands: in Cell surface dynamics: concepts and models. New York, p.223-275, 1983. Posner R. G., Wofsy C., Goldstein B. The kinetics of bivalent ligand-bivalent receptor aggregation: ring formation and the breakdown of the equivalent site approximation. Math. Bioscience., v. 126, p.171-190, 1995. , , Биокинетика. Москва: Наука 1999. Abraham R. Tzafriria., David Wua, Elazer R. Edelmana. Analysis of compartmental models of ligand-induced endocytosis. Theoretical Biology, p.127–138 2004. Nunes-Correia, Isabel (Univ of Coimbra); Ramalho-Santos, Joao; Nir, Shlomo; Pedroso de Lima, Maria C. Interactions of influenza virus with cultured cells: Detailed kinetic modeling of binding and endocytosis. Biochemistry, p.1095-1101, 1999. , Изучение влияния рецепторной специфичности штаммов вируса гриппа на кинетику вирус - клеточного взаимодействия. Новосибирск, 2006.