Работа на тему: «Вирус гриппа» (стр. 4 )

DND-167 имеет большую р-систему. В водной среде он может существовать как в виде положительно, так и отрицательных ионов. Концентрация каждой из его форм зависит от значения рН среды. При повышении рН он депротонируется превращаясь в отрицательный ион, при понижении соответственно, наоборот. Калибровочная зависимость интенсивности флюоресценции DND-167 от величины рН позволяет изучать кинетику лизосомальной активации клетки, индуцированной проникновением вируса в клетку.

Для проверки степени применимости красителя DND-167 к нашей задаче был снят спектр флуоресцении для различных pH среды.

Измерения проводились спектрофлуориметре RF-520 (Shimadzu, Япония) (Рисунок 6). Для исследования изменения спектра флуоресценции было приготовлено четыре пробирки с разными пробами. Каждая проба помещалась во флуориметр, где в течение всего эксперимента облучалась одной и той же длиной волны (360нм.). При помощи флуориметра измерялся спектр эмиссии пробы в диапазоне 380-500 нм. (рабочий диапазон красителя LysoSensor Blue DND-167 по паспортным данным) (Рисунок 7).

Образцы DND167 приготовлены в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), поддерживающем определённые значение рН. Для проведения эксперимента были выбраны следующие значения pH: 2, 4,3, 5,3, 6,4. pH измерялся при помощи pH метра PerpHecT METER (погрешность ± 0.05). Общая концентрация красителя во всех пробах была одинаковой.

Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна интенсивности поглощённого излучения и вероятности излучения кванта при переходе из возбужденного состояния в основное, то есть квантовому выходу флуоресценции:

Iфлуоресценции = Iпоглощённая·φ ,

где φ - квантовый выход флуоресценции.

Из представленных на рисунке 7 результатов видно, что спектры поглощения и флуоресценции зависят от значения рН. Отсюда можно сделать вывод о некоторых деталях механизма флуоресценции.

Зависимость интенсивности флуоресценции от рН:

Но квантовый выход флуоресценции φ от рН не зависит, то есть:

Таким образом, показано, что уменьшение флуоресценции DND-167 при уменьшении рН вызвано не уменьшением квантового выхода, а уменьшением величины поглощения. Этот результат необходим для адекватной оценки полученных данных при работе с данным флуорофором на имеющемся оборудовании.

Также необходимо заметить, что длина волны пика флюоресценции (Рисунок 7) изменяется не более, чем на 4-5нм. и составляет , что является незначительным при сравнении с изменением интенсивности флуоресценции в пробах с различными pH.

TECAN Infinite 200 Разработанная в теоретической части работы кинетическая модель позволяет выделить два основных параметра, характеризующих взаимодействие вируса с клеткой – это константа диссоциации, константа проникновения и скорость изменения внутриэндосомальной рН. Экспериментальные исследования на монослое культуры клеток MDCK с использованием штамма вируса гриппа А/Aichi/2/68 и фетуина, молекулы-блокатора связывания вируса с клеткой, проводились на флуориметре TECAN серии Infinite 200 (Рисунок 8). Детектор в Infinite 200- ФЭУ, опционально чувствительный в УФ и красной областях; диапазон длин волн для измерения интенсивности флуоресценции: Ex 230 – 850 нм, Em 280 – 850 нм. (Рисунок 9); оптическая ширина щели Ex: < 9нм. для л>295нм., Em: <20нм.; точность развертки спектра <±2нм. для л>295нм.; диапазон измерения поглощения 0– 3OD с точностью < ± (1% + 0.010 OD). Температурный диапазон - 5єС до 42єС (поддерживается с точностью до 0.5 єС).

При добавлении в лунку к окрашенному DND-167 клеточному монослою вирусной суспензии, происходит связывания вирионов с клеточными рецепторами за время порядка 5-10 минут, что приводит к пониженю pH в результате действия транс-мембранного потенциала и, как следствие, росту интенсивности флуоресценции лизо-сенсора. Из данных, полученных при изучении спектра флуоресценции красителя DND-167 (Рисунок 7), можно сделать вывод, что чувствительности прибора (0.5 fmol/лунка при измерении поверхностной флуоресценции) и точности измерения интенсивности флуоресценции TECAN Infinite 200 для каждой лунки планшета-96black, будет достаточно при изменении pH в диапазоне от 6 до 5 (что соответствует диапазону изменения pH на поверхности и в эндосоме клетки при проникновении вирусной частицы).

Во время снятия зависимости интенсивности флуоресценции от времени, параллельно отслеживалось появление флуоресцирующих меток в клеточной суспензии на инвертированном микроскопе Olympus CK40. Первые исследования, проведенные на планшете 96-white показали, что помимо флуоресценции, спровоцированной активацией лизо-сенсора DND-167, имеется сильная флуоресценция самого пластика планшета, что вносит большие помехи, создавая неравномерный фон (таким образом в микроскопе наблюдались четкие светящиеся границы лунок микропланшета). Дальнейшие эксперименты проводились на черных 96 - луночных планшетах с прозрачным дном, что дало возможность в разы уменьшить фон окружения. При микроскопическом изучении культуры клеток результат активации лизо-сенсора наблюдали в виде большого количества светящихся точек в клеточной суспензии, которые отсутствовали до активации.

Алгоритм определения параметра IC50=Kd методом флуоресцентной детекции

Готовятся растворы фетуина (1мг/1мл PBS). Добавляется в 96-луночные круглодонные стерильные планшеты по 100 мкл поддерживающей среды RPMI Готовятся серийные двукратные разведения блокатора фетуина, начиная с разведения 1:20 путем переноса 50 мкл пробы в последующую лунку; из лунок последнего ряда удаляется 50 мкл после последнего разведения блокатора. Добавляется в лунки по 50 мкл вирусной суспензии, содержащей ~500 ФОЕ вируса; инкубация 30 мин при температуре 35оC Добавляется LysoSensorBlueDND-167 к концентрированной клеточной суспензии в соотношении 1/500. Инкубирование при 35 оC в течение 20 минут. Разводится окрашенная DND-167 клеточная суспензия поддерживающей средой RPMI (35 оC) в 10 раз, добавляется в планшет по 50 мкл в лунку к суспензиям вирус-фетуин. Проводятся измерения во флуориметре Infinite 200 при 37 оC в течение необходимого времени (время исследуемого в данной работе процесса 20-30 минут)

Полученная зависимость интенсивности флуоресценции от времени для различных концентраций блокатора фетуин, позволяет найти параметр эффективности ингибитора IC50 за счет 50% подавления сигнала интенсивности флуоресценции красителя DND-167.

В отличие от биологического метода (Фокусообразующих единиц (ФОЕ)), методика флуоресцентной детекции более точно определяет эффективность ингибитора за счет высокой чувствительности прибора. Также, что немаловажно при работе с живыми системами, данный метод позволяет проводить все необходимые манипуляции в течение 25 минут, в отличие от метода ФОЕ, требующего большего времени (порядка 24 часов).

Решение обратной задачи для нахождения кинетических параметров системы вирус-клетка.

Получение зависимости интенсивности флуоресценции от времени при проникновении вируса в клетку дает возможность определять константы скоростей связывания вирусных частиц с клеточными рецепторами (k+ и k_) и проникновения внутрь клетки (kin) данной системы решая обратную задачу с помощью подбора соответствующих параметров в уравнениях, описывающих адсорбцию вируса на клетке:

его проникновение внутрь клетки:

и суммарную концентрацию вируса, участвующего в процессе эндоцитоза:

В нашем случае мы детектируем сигнал, как с поверхности клетки, так и внутри нее. Однако, снаружи и внутри клетки заведомо разные pH, т. е. одно и то же количество частиц DND-167 (а значит и вирусных частиц) снаружи клетки и внутри будут давать разную интенсивность флуоресценции. Таким образом. детектируемый нами сигнал есть сумма интенсивностей внутри (Iin - описывается уравнением концентрации вирусных внутри клетки(3.5)) и на поверхности (Is - описывается уравнением концентрации адсорбировавшихся вирусных частиц(3.4)), с соответствующими коэффициентами

I=a·Is+b·Iin

Таким образом суммарная интенсивность флуоресценции от времени, детектируемая прибором:

Поскольку эти коэффициенты a и b взаимозависимы, то положим a=1.

Границы соотношений коэффициентов a и b определяются из данных, приведенных на рисунках 7 и 10.

Согласно этим данным, соотношение между интенсивностью при pH=6 и интенсивностью при pH=5,5 равно примерно 2,5, т. е.:

Таким образом, полученная зависимость I(t) (3.8) может быть записана в виде:

В итоге, полученная экспериментально интенсивность флуоресценции может быть описана уравнением (3.11) для нахождения необходимых кинетических параметров, а теоретическая зависимость концентрации вируса на поверхности и внутри клетки, изображенная на рисунке 2, приобретает вид: