Обоснование возможности использования производных хитозана для повышения иммуногенности гриппозных и полиомиелитных вакцин (стр. 2 )

Апробация диссертации состоялась 29 мая 2012 г на совместной конференции Кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. , лаборатории механизмов регуляции иммунитета и лаборатории РНК-содержащих вирусов ФГБУ «НИИВС им. » РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.  Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, девяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 189 источников (68 отечественных и 121 зарубежный). Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, иллюстрирована 3 рисунками и 29 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Препараты. В работе использовали инактивированные гриппозные: сплит-вакцина «Ваксигрип» (Sanofi Pasteur, Франция), «Флюарикс» (GlaxoSmithKlein, Нидерланды); субъединичные «Агрипал» и «Агрипал S1» (Novartis vaccines and diagnostics, Италия). В качестве живой холодоадаптированной гриппозной вакцины (ХА ЖГВ) использовали холодоадаптированный штамм А/Краснодар/101/35/59(Н2N2) - донор для живых гриппозных вакцин (Патент № 000 РФ). 

Штаммы вируса гриппа: А: AIVR-116 (H1N1), А/Калифорния/7/2009 (H1N1), А/Brisbane/59/07 (H1N1), A/PR8/34 (H1N1), А/Перт/09/87 (H3N2), А/Краснодар/101/59 (H2N2), А/Утка Пенсильвания/ 10218/84  (H5N2), A/Urugway/1716/2007 (N3N2).

Полиовирусы и полиовакцины: инактивированная вакцина «Имовакс Полио» (Sanofi-Pasteur, Франция); живая полиовакцина для перорального применения 1,2,3 типов (ФГУ «ПИПВЭ» им. РАМН, Москва); инактивированные штаммы Сэбина вируса полиомиелита 1,2,3 типа (NIBSC, WHO International Laboratory for Biological Standards, Великобритания).

Адъюванты: высокополимерный хитозан («Сонат», Москва, РФ), 300 kDa, степень деацетилирования 85%. Суспензию микро/наночастиц сульфата хитозония (МЧ СХ) получали путем добавления сульфата натрия до конечной концентрации 25 mM к 0,1 % раствору ацетата хитозония. Образующуюся суспензию микро/наночастиц СХ концентрировали центрифугированием. Рабочую концентрацию суспензии готовили на 0,2 M фосфатном буфере (pH 7,2) с добавлением NaCl до физиологической концентрации 0,9%. N-сукциноил хитозония, глютамат-сукцинат хитозония, хлорид хитозония и ограниченно-деполимеризованный глютамат хитозония (предоставлены , ГНЦ «ВНИТИ БП» РАСН); реацетилированный хитозан (хитин) и производные хитозана, сделанные на основе хитозана фирмы «Сонат» (предоставлены , ФГБУ «НИИВС им » РАМН).

Экспериментальные животные. Мыши линий СВА, BALB/с и беспородные, весом 12-14 и 16-18 г, из питомника НЦ Биомедицинских технологий РАМН «Андреевка».

Метод определения инфекционной активности вируса гриппа на куриных эмбрионах проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03 (Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов).

Иммунизация животных. Мышей вакцинировали в/м, двукратно с интервалом в 21 день, вводя по 0,2 мл  препарата, содержащего по 3 мкг каждого компонента вакцины и 0,5% препарата хитозана (в конечной концентрации) или буфера. При мукозальной иммунизации ХА ЖГВ мышам под легким эфирным наркозом в тех же режимах вводили и/н 50 мкл десятикратных разведений вирусного материала, содержащего 0,5% препарата хитозана (в конечной концентрации). При мукозальной иммунизации ИГВ мышам вводили и/н 50 мкл вакцины, содержащей 0,75 мкг белка каждого серотипа и 0,5% препарата хитозана. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь и затем препарировали, извлекая различные отделы респираторного тракта и легкие.

Анализ специфических ингибирующих гемагглютинацию антител проводили в реакции РТГА по стандартной методике [Kendal A. et al., 1984].

Уровень антител в сыворотках животных определяли при помощи твердофазного метода ИФА [, и соавт., 1991].

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) с вирусом гриппа проводили согласно МУ 3.3.2.1758-03. За титр сыворотки принимали предельное разведение, вызывающее полную задержку гемагглютинации.

Мононуклеарные лейкоциты периферической крови доноров (МЛПК) и селезенок мышей (МЛ) выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-урографина по методу [A. Boyum, 1968].

Дендритные клетки (ДК) получали из МЛПК доноров и МЛ селезенок мышей линии BALB/с по стандартной методике [ c соавт., 2002]. Культивирование клеток проводили в присутствии факторов роста (GM-CSF и IL-4). Для активации ДК использовали инактивированные гриппозные  вакцины (по 50 мкл/мл, содержащих 0,75 мкг белка каждого серотипа) с хитозаном (0,5 %) и TNF-б (20 нг/мл) положительный контроль).

Определение экспрессии поверхностных и эндосомальных маркеров мононуклеарными лейкоцитами и ДК проводили при помощи моноклональных антител («Caltag Laboratories», США) против соответствующих антигенов. Результаты учитывали на проточном цитометре FC-500 («Beckman Culter», США).

Уровень цитокинов определяли:

̶ в супернатантах культур ДК мышей при помощи тест-системы FlowCytomixMouse Thl/Th2 10 plex с использованием шариков, сенсибилизированных моноклональными антителами к цитокинам (GM-CSF, IFN-г, IL-1в, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-a), производства BenderMedSystems (Австрия) согласно инструкции производителя с использованием проточного цитометра FC-500 (Beckman Culter, США);

– в сыворотке/плазме мышей методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Biosource» (Австрия) в диапазоне детектируемых концентраций от 1 до 3 пкг/мл.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных программ Excel (Microsoft Corporation, США), интегрированным пакетом статистического анализа Statgraphics Plus v5.0 (Manugistics Group, Inc., США), WinMdi, StatSoft 7.0 (Windows 2007) с применением параметрических (t-критерия Стьюдента) и непараметрических (критерия Вилкоксона) методов сравнения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Сравнительное изучение адъювантных свойств производных хитозана

Исследована зависимость адъювантных свойств группы производных хитозана от особенностей их химического строения при совместном введении с инактивированными гриппозными (ИГВ) Ваксигрип и Флюарикс вакцинами. Наиболее выраженными адъювантными свойствами характеризовались растворы глютамата высокомолекулярного (200 kDa) и ограниченно деполимеризованного хитозония (ММ 67кDa), а также суспензия микро/наночастиц реацетилированного хитозана, что подтверждено в двух серологических реакциях  ̶  РТГА и ИФА (табл.1).

Таблица 1

Адьювантные свойства производных хитозана при парентеральном введении мышам в комбинации с инактивированными гриппозными вакцинами

№	Модификация хитозана	Титр сывороточных АТ к вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007 (H1N1);
РТГА  (M±SD)	ИФА (M±SD)
Ваксигрип	Флюарикс	Ваксигрип	Флюарикс
1	N-сукциноил хитозана ( натриевая соль)	74,6± 48,8	40,0± 24,0	2400± 1131	2000± 1697
2	Глютамат-сукцинат хитозония (солевая форма)	394± 203,2	181,3± 66,6	–	–
3	Глютамат хитозония (солевая форма) ММ 67 kDa, ГХ	1237± 728*	960± 452*	38400± 18101*	42666± 14780*
4	Глютамат хитозония (солевая форма) ММ  200 kDa, ГХ	1413,3± 97,3*	533,3± 184,1*	76800± 22627*	68266± 59119,5*
5	Хлорид хитозония (солевая форма)	213,3± 73,7	106,6± 37,6	–	–
6	Реацетилированный хитозан (хитин, микро/наночастицы)	–	480 ± 277 *	32000± 20238*	38400± 18101*
7	Вакцина +0,9% р-р натрия хлорида	213,3± 73,7	90,6± 33,3	4800± 2262	4266± 1847

Примечание. К инактивированным гриппозным вакцинам добавляли равные количества 1% р-ра или 1% суспензии микро/наночастиц производных хитозана. Сыворотку крови исследовании на 10 сут. после 2-кратной внутримышечной иммунизации мышей с интервалом в 21 сут. В скобках – кратность повышения титра антител по сравнению с вакциной без производных хитозана; *– р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Учитывая потенциальную роль хитина в аллергических реакциях [Burton, Zaccone, 2007; Reese et al., 2007], в дальнейших экспериментах суспензия микро/наночастиц реацетилированного хитозана была заменена на другую мелкодисперсную форму – суспензию микро/наночастиц сульфата хитозония (МЧ СХ) (табл.2). 

Таблица 2

Изучение адьювантных свойств раствора глютамата хитозония и суспензии микро/нананочастиц сульфата хитозония при парентеральной иммунизации мышей инактивированными гриппозными вакцинами (ИГВ) Ваксигрип и Флюарикс

Вакцины	Титры сывороточных АТ, ингибирующих гемагглютинацию у  иммунизированных мышей (РТГА) (M±SD)	Титры сывороточных IgG-АТ у  иммунизированных мышей ( ИФА) ( M±SD)	Титры секреторных IgA-АТ  у иммунизированных мышей в легких и различных отделах респираторного тракта***  (ИФА) (M±SD)
H1N1*	H3N2**	H1N1	H3N2	носоглотка	трахея	легкие
Ваксигрип + 0,5% р-р глютамата хитозония	1493,3± 661,98 (3,5)	2986± 1355 (5,6)*	170666± 41804,6 (7,9)*	682666± 236482 (8)*	33,3± 9,9 (2,5)	20	106,6± 19,7 (3,2)
Ваксигрип + 0,5% сусп. микро/наночастиц сульфата хитозония	1066± 369,5 (2,5)	2133,3± 739 (4)*	42666,6± 14780,2 (2)	170666± 41804 (2)	46,6± 30,5 (3,5)	20	53,3± 23 (1,6)
Ваксигрип + 0,9% р-р натрия хлорида	426,6± 260,5	533± 184,7	21333,3± 7390,6	85333± 19706	13,3±5,7	<10	33,3± 9,9
Флюарикс +0,5% р-р глютамата хитозония	533,3± 234,4 (8)*	2133± 739 (8)*	136533,3± 39413,9 (12,8)*	341333± 117779(6,5)*	26,6± 11,5(2,6)	10	<10
Флюарикс+ 0,5% сусп. микро/наночастиц сульфата хитозония	853,3± 322 (12,8)*	1280± 0,0 (4,8)*	52906,6± 20707,6 (4,9)*	682666± 236482 (12,9)*	26,6± 11,5(2,6)	10	26,6±1 1,5 (2,6)
Флюарикс+0,9% р-р натрия хлорида	66,6± 20,7	266,6± 130,2	10666± 3695	52906± 20707	10	<10	20
Контроль (сыворотка неиммунных мышей)	<20	<20	346,9	458,2	<10	<10	<10

Примечание. * A/Brisbane/59/2007 (H1N1); ** A/ Urugway/1716/2007 (H3N2); *** AIVR-116 ( H1N1); В скобках – кратность повышения титра антител по сравнению с вакциной без производных хитозана. Достоверным считали не менее  чем 4-кратное повышение титра АТ.