Обоснование возможности использования производных хитозана для повышения иммуногенности гриппозных и полиомиелитных вакцин (стр. 3 )

2. Повышение иммуногенности инактивированных гриппозных вакцин при использовании производных хитозана

Выбранные производные хитозана  ̶  глютамат хитозония (ГХ) и микро/наночастицы сульфата хитозония (МЧ СХ) в составе  инактивированных гриппозных вакцин (ИГВ) существенно повышали у мышей титр антител (АТ) к вирусам гриппа А/H1N1 и А/H3N2 в реакциях РТГА и ИФА (табл.2) по сравнению с введением Ваксигрип и Флюарикс без препаратов хитозана. Важнейшим показателем действия вакцин является их протективный эффект, что было изучено по показателям размножения вируса гриппа в легких 2-кратно иммунизированных мышей (табл.3).

У неиммунизированных мышей инфекционная доза, вызывающая размножение вирулентного штамма вируса А/H1N1/Брисбейн/59/2007 в легких, составляла 102,0 ЭИД50; у иммунизированных ИГВ Ваксигрип она возрастала до 104,0 ЭИД50. Введение Ваксигрип с ГХ значительно повышало защитный эффект: только инфекционная доза штамма, равная 106,0 ЭИД50, вызывала инфекционный процесс в легких иммунизированных животных. Введение в вакцину суспензии МЧ СХ приводило к еще большему увеличению инфекционной дозы вирулентного штамма, способной вызвать инфекционный процесс.

Таблица 3 

  Изучение защитного эффекта иммунизации мышей вакциной Ваксигрип в комбинации с препаратами хитозана 

Доза вирулентного  штамма Брисбейн/59/2007 (H1/N1), ЭИД50/0,05мл	Размножение вируса в легких иммунизированных  мышей, инфицированных впоследствии интраназально  различными разведениями вирулентного штамма A/Брисбейн/59/2007 (H1/N1)*
Неиммунизир. мыши (контроль)	Ваксигрип + физ. р-р	Ваксигрип +0,5%  р-р ГХ	Ваксигрип + 0,5 % суспензия МЧ СХ
107,0	4/4*	4/4	4/4	2/4
106,0	4/4	4/4	2/4	0/4
105,0	4/4	4/4	0/4	0/4
104,0	4/4	2/4	0/4	0/4
103,0	4/4	0/4	0/4	0/4
102,0	2/4	0/4	0/4	0/4
101,0	0/4	0/4	0/4	0/4

Примечание. * в знаменателе - количество куриных эмбрионов, инфицированных суспензией легких 2-кратно иммунизированных мышей, в числителе – количество куриных эмбрионов, в которых наблюдали размножение вируса (представлены результаты одного из 4-х опытов). 

Таким образом, введение ГХ и МЧ СХ в состав ИГВ значительно повышало их защитную эффективность.

3. Повышение иммуногенности живых гриппозных вакцин при использовании производных хитозана

       Для оценки влияния производных хитозана на защитный эффект живых гриппозных вакцин иммунизацию проводили интраназально 2-кратно холодоадаптированным (ХА) штаммом вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 (Н2N2), являющегося донором аттенуации для живых вакцин. При иммунизации ХА штаммом подавление размножения вирулентного штамма вируса гриппа А/Краснодар/ 101/59 (Н2N2) в легких наблюдали только у мышей, иммунизированных дозой 106,0 ЭИД50 вакцинного вируса (табл.4).

Таблица 4

Влияние глютамата хитозана на защитный эффект при интраназальной иммунизации мышей холодоадаптированным штаммом-донором А/Краснодар/101/35/59

Дозы ХА штамма-донора А/Краснодар/ 101/35/59 (Н2N2)  для  и/н иммунизации (ЭИД50/0,05мл)	Размножение вирулентного штамма А/Краснодар/ 101/59 (Н2N2) в легких мышей, иммунизированных  интраназально ХА штаммом-донором А/ Краснодар/ 101/35/59 (Н2N2)
иммунизация с ГХ*	иммунизация без ГХ*
106,0	< 101,0	101,5
105,0	< 101,0	102,5
104,0	< 101,0	103,0
103,0	< 101,0	103,0
102,0	103,0	103,0

  Примечание. Инфекционный титр штамма А/Краснодар/101/59 (Н2N2) в легких неиммунизированных мышей равнялся 103,0 ЭИД50. Титрование проводили на куриных эмбрионах, инфицированных суспензией легких 2-кратно иммунизированных мышей. ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза.

Включение ГХ в состав вакцины приводило к подавлению размножения вирулентного вируса в легких мышей, иммунизированных дозами вакцинного ХА штамма 105,0 ЭИД50, 104,0 ЭИД50, 103,0 ЭИД50. При этом в РТГА отмечали увеличение образования сывороточных антител, задерживающих гемагглютинацию: к ХА штамму-донору в 4 раза при вакцинации дозой вируса 105,0 ЭИД50/0,05 мл и в 8 раз при вакцинации дозой вируса 103,0 ЭИД50/0,05 мл по сравнению с контролем. При исследовании титров противогриппозных антител в ИФА после интраназальной иммунизации установлено, что ГХ в комбинации с ХА живой гриппозной вакциной (ЖГВ) способствовал значительному повышению титров IgG-АТ в сыворотке крови и sIgА-AТ в респираторном тракте мышей. Полученные результаты свидетельствуют о значительном повышении защитного эффекта и/н вакцинации ЖГВ при введении в вакцинный материал ГХ.

4. Особенности иммунного ответа при иммунизации мышей полиомиелитной вакциной в комбинации с производными хитозана

В исследованиях использовали инактивированные формалином штаммы Сэбина полиовируса типов 1, 2 и 3 в комбинации с производными хитозана. Мышей иммунизировали в/м и определяли уровни IgG-АТ в сыворотках крови  (табл. 5). Титр IgG-АТ в сыворотке мышей, иммунизированных полиовирусами 1, 2 и 3 типов составил 2660; 4266 и 10666, соответственно, после двукратной иммунизации, и 10666; 5333 и 17066, соответственно, после трехкратной.

Таблица 5

Титры IgG-АТ в сыворотках мышей, иммунизированных  инактивированными штаммами Сэбина полиовируса (ПВ) типов 1,2,3 в комбинации с производными хитозана 

№	Инактивированный материал для внутримышечной иммунизации мышей	Титры IgG-АТ  в сыворотке иммунизированных мышей (ИФА)
двукратная иммунизация	трехкратная иммунизация
ПВ 1 типа + 0,9% р-р NaCl	2660±923,7	10666±3695,3
ПВ 1 типа + 0,5% р-р ГХ	85333±29560*  (32)	102400±0,0* (9,6)
ПВ 1 типа + 0,5 % сусп. МЧ СХ	68266±17083*  (23)	70666±53969,3*(6,6)
ПВ 2 типа + 0,9% р-р NaCl	4266±1847,5	5333±1847,5
ПВ 2 типа + 0,5% р-р ГХ	119466±78209,2*(28)	136533±59120,4*(25,5)
ПВ 2 типа + 0,5% сусп. МЧ СХ	85333±29560,5*  (20)	102400±0,0* (19,2)
ПВ 3 типа + 0,9% р-р NaCl	10666±3695,5	17066±5396,4
ПВ 3 типа + 0,5% р-р ГХ	85333±29560,1*  (8)	273066±118241*  (16)
ПВ 3 типа + 0,5% сусп. МЧ СХ	42666±14780,4*  (4)	85333±29560,5*(5)

Примечание. В скобках указана кратность повышения титров антител по сравнению с инактивированным полиовирусом без адъюванта. * Достоверным считали повышение титра антител в 4 и более раз.

Введение в состав инактивированного препарата ПВ типов 1,2,3 ГХ повышало титр IgG в 32; 28 и 8 раз, соответственно, после двукратной иммунизации, и в 9,6; 25,6 и 16 раз, соответственно, после трехкратной иммунизации.

Аналогичным образом при введении в состав инактивированного препарата полиовируса типов 1, 2, 3 суспензии МЧ СХ наблюдалось повышение титра сывороточных антител в 25,6, 20 и 4 раза, соответственно, после двукратной иммунизации и в 16, 19,2 и 5 раз, соответственно, после трехкратной иммунизации. Это указывает на выраженный адьювантный эффект производных хитозана в отношении инактивированных штаммов полиовируса всех типов и подтверждает его эффективность, выявленную ранее на модели инактивированных гриппозных вакцин.

Выявленные адъювантные свойства ГХ и МЧ СХ при введении с инактивированными и живыми вирусными вакцинами при парентеральном и мукозальном методах введения, явились основанием для изучения молекулярно-клеточных механизмов их действия.

5. Молекулярно-клеточные механизмы адъювантного действия хитозана  на эффекторы иммунитета

Известно, что первым этапом активации иммунного ответа является распознавание консервативных молекулярных структур микроорганизмов клетками системы врожденного иммунитета с помощью паттерн-распознающих рецепторов, включая семейство сигнальных Толл-подобных рецепторов (Toll-like-receptors - TLRs). Для вирусов - это TLRs 3, 7, 8, 9.

5.1. Экспрессия TLRs под воздействием инактивированных и живых вирусных вакцин в сочетании с производными хитозана

Экспрессия эндосомальных TLRs в дендритных клетках человека. Активацию эндосомальных TLRs 3, 7, 8, 9 под влиянием вирусных антигенов в комбинации с производными хитозана исследовали при действии живых и инактивированных вирусных вакцин в комбинации с ГХ в качестве адъюванта в дендритных клетках (ДК) человека на восьмые сутки инкубации (табл. 6).

Таблица 6

Влияние инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с глютаматом хитозония на экспрессию эндосомальных TLRs в ДК человека

№	Препарат	% от общего количества анализируемых клеток, (M±SD)
TLR3	TLR7	TLR8	TLR9
1	ДК+0,9% р-р NaCl	14,3±0,73	27,9±0,5	22,4±0,83	8,2±0,7
2	ДК+ГХ	11,73±1,6	24,1±0,5	26,3±1,01	13,5±1,1
3	ДК+Агрипал S1(ИГВ)	14,5±1,0	33±2,7	29,1±7,2	15±1,6*
4	ДК+Агрипал S1(ИГВ)+ГХ	17,5±1,0	41,5± 1,5**#	42±1,4**#	31,5±1,5**#
5	ДК+живая ХА ГВ	17,2±1,2	46,6±2,3**	70,5±4,4**	8,1±1,5
6	ДК+ живая ХА ГВ+ГХ	27,3±1,57*#	77,3±3,4**#	74,8±3,6**	33,1±2,5**#
7	ДК+ Имовакс-Полио	13,3±1,2	34,1±2,55*	36,3±1,65*	11,6±1,1
8	ДК+Имовакс-полио+ГХ	18,3±1,85*#	38,4±2,5*	47,5±4,7**#	13,3±1,3*#
9	ДК+ ЖПВ	16,4±1,6	50,3±3,17**	61,5±4**	10,6±1,25
10	ДК+ЖПВ +ГХ	25,4±1,9*#	60,3±4,2**#	73,8±3,7**#	30,1±2,54**#

Примечание. Достоверность различий по сравнению с контролем (группа 1): * – p<0,05; **–p<0,01, # – p<0,05 между группами 3 и 4; 5 и 6; 7 и 8. ХА ГВ – холодоадаптированная гриппозная вакцина, ЖПВ – живая полиовакцина, ГХ – глютамат хитозония.