Обоснование возможности использования производных хитозана для повышения иммуногенности гриппозных и полиомиелитных вакцин (стр. 1 )

На правах рукописи

ПЕРЕВЕРЗЕВ

Александр Дмитриевич

ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ  ХИТОЗАНА ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ ГРИППОЗНЫХ

И ПОЛИОМИЕЛИТНЫХ ВАКЦИН

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

03.02.02 – вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении

«Научно-исследовательский институт  вакцин и сывороток

им. » РАМН

  Научные руководители:  доктор медицинских наук

 

  доктор медицинских наук

  Ахматова Нэлли Кимовна

  Официальные оппоненты: 

  , доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИВС им.

  » РАМН, ведущий научный сотрудник лаборатории

  терапевтических вакцин;

  Бурцева Елена  Ивановна,  доктор медицинских наук, ФГБУ «НИИ вирусологии

  им » Минздравсоцразвития Россиии, заведующая лабораторией

  этиологии и эпидемиологии гриппа.

  Ведущая организация: ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов 

  им. » РАМН.

  Защита диссертации состоится 20 декабря 2012 г. в  14 часов на заседании 

  диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИВС им. »

  РАМН Москва, Малый Казённый пер., д.5а.

  С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИВС им. И. И.

  Мечникова» РАМН.

  Автореферат разослан  ноября 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инактивированные вирусные вакцины  в течение последних 50 лет широко используются в борьбе с вирусными заболеваниями. Однако некоторые из них обладают серьезными недостатками. Так, в частности, гриппозные вакцины  являются недостаточно эффективными для лиц пожилого возраста [Gross et al., 1995; Palachi, 1997; Khurana et al., 2012; Kositanont et al., 2012] и не способны защищать от дрейфовых вариантов вируса гриппа [Belshe et al., 2000; De Yong, 2000; Cox et al., 2004]. С другой стороны, инактивированные полиомиелитные вакцины обладают относительно низкой иммуногенностью, и для создания прочного иммунитета против полиомиелита требуется многократная иммунизация.

В настоящее время для повышения эффективности вакцин в экспериментальных и клинических исследованиях применяют адъюванты различного происхождения: минеральные соли (гидроксид или фосфат алюминия и др.); растительные (сапонины – QuilA, QS21); микробные (убитые бактерии, липополисахарид и его производные, CpG-мотивы ДНК) и др. [Kovacs-Nolan et al. 2009; Olafsdottir et al. 2009].

Вследствие токсичности или недостаточной эффективности большинства адъювантов для широкого клинического использования разрешены только соли алюминия и водно-масляная эмульсия MF-59, а в некоторых странах вирусоподобные частицы (VLP – virus-like particles) и иммуностимулирующий комплекс (ISCOM -  immunostimulating complex) [Valiante et al., 2003; Baudner et al. 2009]. Зарубежные коммерческие гриппозные вакцины выпускаются лишь с одним адъювантом MF-59, и такие вакцины оказались более иммуногенными при вакцинации  пожилых лиц, однако, обладали повышенной реактогенностью [Podda, 2001; Podda, Del Guidici,2003]. 

В литературе появились сообщения об использовании природного катионного полисахарида – хитозана в качестве мукозо-адгезивного адъюванта для инактивированных гриппозных и некоторых других вакцин, вводимых мукозально [Bacon et al, 2000;  Illum et al., 2001; Thanou et al., 2001; Illum, 2003; van der Lubben et al.,2003; Kang et al., 2009; Prego et al.,2010]. Хитозан является линейным полимером, состоящим из мономеров D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина, и отличающимся низкой токсичностью, биодеградируемостью и биосовместимостью. В последние годы было показано, что хитозан повышает эффективность инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин при парентеральном введении [Zacharow et al., 2007; Ghendon et al, 2008; Ghendon et al, 2011]. Однако, несмотря на большой интерес к данному полимеру, многие аспекты иммунологической активности хитозана и его практического применения остаются до настоящего времени малоисследованными. Отсутствует информация о сравнительной адъювантной активности различных форм производных хитозана (растворимых, мелкодисперсных и. т.д.), а также  о влиянии производных хитозана на врожденные механизмы иммунитета при парентеральной и мукозальной иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

  Цель исследования: изучение адъювантных свойств производных хитозана на модели гриппозных и полиомиелитных вакцин с оценкой молекулярно-клеточных механизмов их действия на эффекторы врожденного и адаптивного иммунитета.

Задачи:

1. Исследовать адъювантные свойства производных хитозана различной химической природы.

2. Изучить влияние производных хитозана на активацию адаптивного иммунитета при иммунизации мышей инактивированными и живыми вирусными вакцинами.

3. Исследовать экспрессию Толл-подобных рецепторов дендритными клетками и спленоцитами мышей в ответ на введение инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана в качестве адъювантов.

4. Оценить цитокиновый профиль мышей при введении инактивированных и живых вирусных вакцин в комбинации с производными хитозана.

5. Определить особенности иммунофенотипа  спленоцитов мышей при иммунизации инактивированными и живыми вирусными вакцинами в комбинации с препаратами хитозана.

Научная новизна работы

Впервые исследовано воздействие высокомолекулярного (ММ 200 kDa) глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония при парентеральном и мукозальном методах введения с инактивированными и живыми гриппозными вакцинами на стимуляцию врожденного и адаптивного иммунитета мышей. Установлена возможность повышения иммуногенности инактивированной полиомиелитной вакцины при включении в ее состав производных хитозана в качестве адъювантов.

Показано, что при парентеральном введении производных хитозана в комбинации с инактивированной гриппозной сплит-вакциной происходило усиление активации врожденного и адаптивного иммунитета у мышей, что проявлялось в экспрессии эндосомальных Толл-подобных рецепторов ДК (TLR7, TLR8, TLR9), индукции синтеза цитокинов в крови IL-12, INF-г, IL-17, IL-1в и IL-5; повышении численности Т (CD3, CD4, CD8, гдT), В лимфоцитов (CD19, CD5), NK (CD16/32), NKT (CD3/NK), T-reg (CD4/CD25/Foxp3) клеток. Включение в состав полиомиелитных вакцин производных хитозана приводило к увеличению численности СD3, CD8, NK, CD3/NK, CD4/CD25/Foxp3 и гдT позитивных клеток и ДК с экспрессией эндосомальных TLRs.

Выявлены общие закономерности цитокиного профиля при иммунизации животных инактивированными и живыми гриппозными и инактивированными полиомиелитными вакцинами: резкое повышение IL-12, умеренное повышение IFN-г и снижение TNF-б. 

Установлено, что мукозальная иммунизация мышей живой гриппозной вакциной в комбинации с  производными хитозана способствовала повышению уровней IgG и sIgA в респираторном тракте мышей и препятствовала размножению вирулентного штамма вируса гриппа в легких мышей; увеличивала содержание TLR2 и TLR9-экспрессирующих клеток, а также субпопуляций В1 (CD5) и T-лимфоцитов (CD3, CD8 и CD4) и NK.

Включение производных хитозана в состав инактивированных гриппозных и полиомиелитных вакцин мобилизует различные звенья врожденного иммунитета, приводя к поляризации иммунного ответа по Th1-типу.

Научно-практическая значимость 

Получено положительное решение Федерального Института промышленной собственности РФ на заявку № 000/15 (020894) «Способ повышения иммуногенности холодоадаптированного донора аттенуации для живых гриппозных вакцин» от 14.04. 2010.

Показана целесообразность использования глютамата хитозония и суспензии микро/наночастиц сульфата хитозония для повышения иммуногенности и защитной эффективности инактивированных и живых гриппозных вакцин, активирующих мукозальный и системный иммунитет при парентеральной иммунизации.

Включение в состав инактивированной полиомиелитной вакцины модифицированных препаратов хитозана в качестве адъювантов позволит повысить иммуногенность  полиомиелитных вакцин.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выявлена зависимость адъювантных свойств производных хитозана от особенностей их химической природы  при наибольшей активности глютамата хитозония и микро/наночастиц сульфата хитозония, которые существенно не различались по адъювантным свойствам при введении с гриппозными и полиомиелитными вакцинами.

2. Введение производных хитозана в состав живых и инактивированных гриппозных  вакцин способно повысить их иммуногенность и защитную эффективность. Введение производных хитозана в состав инактивированных полиовакцин повышает их иммуногенность.

3. Производные хитозана в составе вирусных вакцин при иммунизации животных приводят к повышению в крови количества Т и В лимфоцитов, NK клеток; уровня провоспалительных (IL-1в, IL-6) и регуляторных (IFN-г, IL-12, IL-17) цитокинов и снижению TNF-б, что устраняет последствия иммуносупрессии, индуцированной вирусными вакцинами, и нейтрализует гиперактивацию иммунной системы при введении живых вакцин.

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные материалы диссертационной работы доложены на: Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2010); IX Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2010), VII Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (2010), научно-практической конференции молодых учёных НИИВС им. РАМН (Москва, 2011), XIV Всероссийском форуме с международным участием им. академика «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «От теории – к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011), X Латино-американском конгрессе иммунологов (Перу, 2012).