Обоснование возможности использования производных хитозана для повышения иммуногенности гриппозных и полиомиелитных вакцин (стр. 4 )

Производные хитозана в разной степени усиливали действие инактивированных и живых гриппозных и полиомиелитных вакцин на экспрессию всех исследуемых эндосомальных TLRs. Наибольший эффект ГХ наблюдали при воздействии живых гриппозных (ЖГВ) и полиомиелитных (ПЖВ) вакцин в отношении TLR9 (увеличение в 4,1 и 2,8 раз соответственно). Высокая активация TLR8 при введении в культуру ДК ЖГВ и отсутствие изменения данного показателя под воздействием ГХ позволяет сделать предположение об иммунокорригирующем действии хитозана. 

       Так как большая часть живых вакцин вводится в организм через слизистые оболочки, вызывая при этом активацию не только местного, но и системного иммунитета, исследовали влияние интраназальной иммунизации на экспрессию TLRs в селезенке мышей.

Экспрессия TLRs спленоцитами мышей при интраназальной иммунизации ЖГВ в комбинации с производными хитозана.

Установлено, что и/н иммунизация мышей ХА ЖГВ приводила к повышению численности TLR9 позитивных клеток (рис.1).

  Рис.1. Влияние производных хитозана в составе живой гриппозной вакцины на экспрессию TLR-2, TLR-4 и TLR-9 спленоцитами мышей.

Примечание. Х/А – холодоадаптированная гриппозная вакцина, Хит – р-р глютамата хитозония, М –суспензия микро/наночастиц сульфата хитозония. *– р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

При включении в состав вакцины ГХ или МЧ СХ происходило более существенное (p<0,05) повышение содержания ТLR9 и TLR2 - экспрессирующих клеток. Известно, что активация TLR-зависимого сигнального пути приводит к активации ядерного фактора транскрипции NF-кВ и экспрессии генов провоспалительных цитокинов и интерферонов I типа [Engel A., Barton G. 2010].

5.2. Экспрессия цитокинов под воздействием инактивированных и живых вирусных вакцин в сочетании с производными хитозана

Экспрессия цитокинов в культуре дендритных клеток (ДК) мышей под воздействием ИГВ Ваксигрип в комбинации с производными хитозана.

Введение в культуру незрелых ДК мышей производных хитозана приводило к заметному повышению уровня IFN-г, IL-1в и IL-5 (рис.2), а  ИГВ Ваксигрип - IFN-г, IL-1в, TNF-б, IL-6 и IL-10.

Рис.2. Влияние ИГВ Ваксигрип в комбинации с производными хитозана на уровень цитокинов в культуре ДК мышей.

Примечание В – Ваксигрип, ГХ - глютамат хитозония, М - суспензия микро/наночастиц сульфата хитозония. * – р<0,05 по сравнению с культурой незрелых ДК ( нДК).

Введение ИГВ в комбинации с производными хитозана индуцировало экспрессию более широкого спектра цитокинов: IFN-г, IL-17, IL-1в, IL-2, IL-5, IL-6 и умеренное снижение IL-4 относительно нДК (P<0,05). Такой спектр цитокинов, в особенности индукция IL-17 и IL-2, может способствовать синтезу хемокинов c привлечением в очаг воспаления моноцитов и нейтрофилов и дифференцировке Т и В лимфоцитов [Kabir S., 2011]. При этом снижение уровня IL-4 также создает оптимальные условия для экспансии и дифференцировки Th1 клеток. Полученные данные позволяют предположить, одним из молекулярных механизмов адъювантного действия хитозана, является прямое взаимодействие фрагментов хитозана с рецепторами ДК. 

Цитокиновый статус мышей при парентеральной иммунизации ИГВ в комбинации с производными хитозана.

Парентеральное (в/м) введение мышам ИГВ сопровождалось повышением в сыворотке крови мышей IFN-г, IL-12, IL-17, TNF-б, IL-5, TGF-в, IL-6, IL-10 (рис. 3). 

Рис.3. Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей в динамике при парентеральном введении производных хитозана совместно с ИГВ Ваксигрип.

Ваксигрип в комбинации с производными хитозана индуцировали (P<0,05) повышение IL-12 (более чем в 10 раз относительно контроля) и умеренное повышение IFN-г, IL-17, IL-1в и IL-5 (относительно ИГВ), что свидетельствует о выраженной активации клеточных механизмов врожденного иммунитета, определяющих направленность активации адаптивного иммунитета. Важно, что при этом происходило снижение продукции TNF-б и TGF-в (по сравнению с ИГВ). Снижение синтеза TNF-б влечет за собой снижение риска системного воспаления. Эти данные могут свидетельствовать о способности хитозана поддерживать цитокиновый баланс и нивелировать вызванную ИГВ чрезмерную активацию иммунной системы.

Индукция цитокинов в культуре спленоцитов мышей при интраназальной иммунизации ЖГВ в комбинации с производными хитозана.

Так как в сыворотках мышей, иммунизированных и/н  ЖГВ в комбинации с производными хитозана, не было выявлено существенных различий в содержании цитокинов по сравнению с интактными мышами, исследовали уровень стимулированных ФГА цитокинов в культуре спленоцитов мышей через 7 суток после I и II иммунизации (рис.4). ЖГВ на первый срок хоть и повышала уровень многих цитокинов (IL-4, IL-17, IL-1в, IL-2, IL-10, IL-12) относительно контроля, но уступала ЖГВ в комбинации с  производными  хитозана в продукции IL-17 (в 4 раз), IL-1в (в 2,4 раза), IL-2 (в 1,25 раза) и IL-12 (в 2,5 раза).  При этом под воздействием ЖГВ отмечалось существенное повышение уровня TNF-б, который является эндогенным пирогеном, участвующим в системном воспалении, подавляющий репликацию вируса, но в то же время, индуцирующий апоптоз клеток и сепсис [Andrisani G, et al., 2012].

Повторная иммунизация ЖГВ приводила к чрезмерной активации иммунокомпетентных клеток, судя по максимальным уровням всех исследованных цитокинов (за исключением IL-12 и IL-17, которые были ниже уровня, индуцированного ЖГВ+ГХ).

Введение мышам ЖГВ в комбинации с ГХ и МЧ СХ (рис.4) приводило к повышению (p<0,05) уровня IL-1в, IL-17, IL-12, IFN-г и IL-6. Эти цитокины относятся к Th-1 индуцирующим, следовательно, можно предположить, что под действием производных хитозана произойдет поляризация иммунного ответа по Th-1 пути.

Также сочетанное введение вакцины с производными хитозана приводило к снижению TNF-б, IL-4 и GM-CSF по сравнению с ЖГВ. Это может свидетельствовать об иммунокорригирующей способности хитозана с регуляцией гиперактивации иммунной системы, вызванной ЖГВ. Таким образом, использование ХА ЖГВ в комбинации с производными хитозана приводит к формированию более сбалансированного иммунного ответа.

 

Рис. 4. Уровень цитокинов (пкг/мл) в культуре спленоцитов мышей, иммунизированных ХА ЖГВ в комбинации  с производными хитозана через 7 сут: А – I  иммунизация, Б - II –иммунизация.

Примечание. * - P<0,05 по сравнению с контролем.

5.3. Иммунофенотип лимфоцитов мышей при парентеральной и мукозальной  иммунизации инактивированными и живыми вакцинами в комбинации с производными хитозана

Субпопуляционная структура лимфоцитов мышей при парентеральной иммунизации ИГВ в комбинации с производными хитозана.

Для выяснения молекулярно-клеточных механизмов действия хитозана на клетки-эффекторы иммунной системы мышей двукратно внутримышечно иммунизировали ИГВ Ваксигрип с производными хитозана и через 1 и 7 суток после каждого введения оценивали иммунофенотип лимфоцитов селезенок (рис.5).

Вакцина без адьюванта в исследуемые сроки увеличивала численность активированных клеток (МНС II), существенно не влияя на их дифференцировку. 

Рис.5. Субпопуляционная структура лимфоцитов селезенок мышей после иммунизации ИГВ с производными хитозана.

Примечание. К – контроль, В – Ваксигрип, ГХ – глютамат хитозана, МЧ – микрочастицы сульфата хитозана.

В группах с производными хитозана и вакциной (В+ГХ) и (В+МЧ) на все сроки наблюдения отмечалось повышение (p<0,05) численности CD3, CD4, CD8, CD19, MHCII, NК, CD3/NK, CD5, гдT, CD4/CD25/Foxp3 (T-reg) позитивных клеток по сравнению с контрольной группой и ИГВ. При этом максимально выраженные изменения были отмечены на 7 сутки второй иммунизации. Обращает на себя внимание постепенное снижение численности  NК и NKT клеток через 7 суток после каждой иммунизации (хотя их численность относительно контроля все же оставалась повышенной), что объясняется угасанием врожденных механизмов иммунитета на эти сроки. В группах с производными хитозана и вакциной (В+ГХ/МЧ) после второй иммунизации отмечалось постепенное снижение численности  MHCII-экспрессирующих клеток по сравнению с ИГВ на фоне возрастания численности популяции Т-регуляторных клеток (CD4/CD25/Foxp3, T-regs), что может свидетельствовать о включении под воздействием хитозана регуляторных механизмов, отвечающих за подавление гиперактивности иммунного ответа. 

Иммунофенотип лимфоцитов мышей при интраназальной  иммунизации живой гриппозной вакциной (ЖГВ) в комбинации с производными хитозана.

Влияние интраназальной (и/н) иммунизации ХА ЖГВ в комбинации с производными хитозана на динамику иммунофенотипа лимфоцитов селезенки мышей изучено через 1 и 7 сут. после однократного  и двукратного введения (рис.6).