Постнатальный морфогенез органов иммунной системы и кожи потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимуляции в ранние сроки беременности (стр. 2 )

Связь между воздействием на иммунную систему материнского организма в первые недели беременности и иммунной системы потомства указывает на необходимость тщательного сбора анамнестических данных педиатрами, а также внесении в амбулаторные карты детей всех данных о перенесённых матерью заболеваниях и действии других повреждающих факторов во время беременности при постановке на поликлинический учёт и госпитализации детей независимо от их возраста.

Полученные данные об изменениях постнатального морфогенеза органов иммунной системы и кожи потомства вследствие однократного иммуностимулирующего воздействия на материнский организм в ранние сроки беременности могут использоваться в преподавании гистологии, цитологии и эмбриологии в  медицинских и биологических высших учебных заведениях, а также при проведении научных исследований.

Внедрение результатов исследования. Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре гистологии, эмбриологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Положения, выносимые на защиту:

Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами в ранние сроки беременности до начала формирования зачатков тимуса и селезёнки плода вызывает нарушения постнатального развития центральных и периферических органов иммунной системы потомства в препубертатном, пубертатном и постпубертатном периодах. Изменения постнатального морфогенеза тимуса заключаются в ускорении развития органа в первые недели жизни за счёт более высокой пролиферации и дифференцировки тимоцитов, с последующим снижением процессов дифференцировки в пубертатном периоде. В постпубертатном периоде происходит замедление инволютивных процессов вследствие более высокой способности тимоцитов к секреции фактора роста ИЛ-2, сниженной продукции антипролиферативных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-в, усиленной пролиферативной активности тимоцитов. Изменения постнатального морфогенеза селезёнки заключаются в замедлении её превращения из органа кроветворения в орган иммунной системы. Морфологические и гистофизиологические изменения тимуса и селезёнки при развитии системного воспалительного ответа характеризуются меньшей выраженностью и более медленным развитием. Недостаточное количество клеток врождённого иммунитета, а затем и приобретённого иммунитета, функциональная незрелость селезёнки в препубертатном и пубертатном периодах обусловливает снижение противоопухолевого иммунитета. Усиление пролиферации и секреции цитокинов лимфоцитами на ранних сроках беременности нарушает пренатальный и постнатальный морфогенез кожи мышей и вызывает развитие транзиторной очаговой алопеции в возрасте 17-ти суток.

Апробация работы: Материалы диссертации доложены и обсуждены на XIX, XX, XXI, XXII Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии (Ялта, Украина, 2011, 2012, 2013, Ялта, Россия, 2014гг.), XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012г.), научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2012г.), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 2012г.), VI Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2013г.), VII Международном конгрессе по интегративной антропологии» (Винница, Украина, 2013г.), Международной научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2014г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 24 работы, из них 12 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 63 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает 356 источников, из них 15 отечественных и 341 зарубежный.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

       Эксперименты выполнены на 486 мышах С57Bl/6, из них 126 самок и 360 самцов (питомник «Столбовая»). Содержание животных и эксперименты были выполнены в соответствии с приказом Минздрава СССР г., «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985г.), правилами лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ ) и законом «О защите животных от жестокого обращения» гл. V, ст. 10, 4679-ГД от 01.01.2001г. На проведение исследования получено разрешение биоэтического комитета ФГБУ «НИИМЧ» РАМН.

Иммуностимулирующее воздействие на беременных самок

Беременность датировали по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке и копулятивной пробки. В качестве иммуностимулирующего воздействия беременным самкам однократно вводили в орбитальный синус Кон А в дозе 5 мг/кг. Данная доза усиливает секрецию цитокинов лимфоцитами и пролиферацию лимфоцитов [Lei H., Chang  C., 2007] и не влияет на течение беременности. В качестве групп сравнения использовали небеременных самок и интактных беременных самок с аналогичным сроком беременности.

Проводили исследование спонтанной, in vitro индукцированной Кон А и ЛПС секреции основных провоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов ФНО-б, ИЛ-2 и ИЛ-10 клетками селезёнки через 72 ч после введения ерез 7 сут после введения Кон А, то есть на 14-ые сутки беременности проводили гистологическое исследование тимуса и селезёнки самок и определяли пролиферацию клеток тимуса и селезёнки.

Исследование постнатального морфогенеза органов иммунной системы и кожи потомства

Объектом исследования было потомство мужского пола (n=360). Первую опытную группу составило потомство самок, которым вводили Кон А на 7-ые сутки беременности (группа Кон А, n=147). Для подтверждения эффектов действия цитокинов и устранения возможных эффектов непосредственного воздействия Кон А на зародыш была сформирована вторая опытная группа из потомства беременных самок, которым на 7-ые сутки вводили активированные in vivo сингенные клетки селезёнки (группа «активированные клетки», n=54). Для этого небеременным интактным самкам вводили Кон А в дозе 20 мг/кг, через 2 ч выделяли клетки селезёнки, и вводили в объёме 0,2 мл (10 млн клеток) самкам на 7-ые сутки беременности. Рассчитанное  максимально возможное количество Кон А, вводимого с клетками было в 10 млн раз меньше, чем минимальная эффективная доза. Ввиду того, что между потомством интактных самок и самок, которым вводили неактивированные клетки селезёнки, не было найдено достоверных различий по исследуемым параметрам, они были объединены в общую контрольную группу (n=159).

Исследования проводили на 17-ые сутки постнатального развития (препубертатный период), в возрасте 1,5 месяцев (пубертатный период) и 2,5 месяцев (постпубертатный период, начало активного репродуктивного периода). Определяли относительную массу тимуса и селезёнки, проводили исследование гистологических препаратов тимуса, селезёнки и кожи, определяли субпопуляционный состав лимфоцитов тимуса и селезёнки, спонтанной секреции ИЛ-2, ИЛ-10, ФНО-б и ТФР-в и секреции после стимуляции Т-клеточным митогеном Кон А и В-клеточным митогеном ЛПС in vitro клетками тимуса и селезёнки, пролиферацию клеток тимуса и селезёнки ex tempore.

Исследование изменений органов иммунной системы потомства при развитии системного воспалительного ответа

Потомству мышей контрольной группы и группы Кон А  в возрасте 17-ти сут. однократно внутрибрюшинно вводили ЛПС E. сoli штамм О111:В4 («Difco», США) в дозе 15 мг/кг. Оценивали выживаемость животных в течение 48 ч. Проводили определение концентрации ФНО-б в сыворотке крови через 3ч. Определяли содержание лейкоцитов и лейкоцитарную формулу крови через 24 ч после введения ЛПС. Остальных животных выводили из эксперимента через 24 и 48 чч после введения ЛПС. Проводили морфологическое исследование тимуса и селезёнки.

Исследования реагирования  иммунной системы потомства при развитии опухолевого процесса

Исследовали цитотоксическую активность клеток селезёнки мышей контрольной группы и самок, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы Кон А на ранних сроках беременности, в возрасте 17-ти суток на линии опухолевых клеток L929.

Для исследования реагирования иммунной системы на длительно протекающий патологический процесс было проведено моделирование опухолевого процесса. Животным опытной и контрольной групп была привита подкожно сингенная опухоль меланома В16. В связи с высоким процентом  развития меланомы после прививки, для снижения приживаемости количество вводимых опухолевых клеток мышам было уменьшено до 104 [Cui N. et al., 2012]. Оценивали приживаемость опухоли, размеры подкожной опухоли и продолжительность жизни животных-опухоленосителей в каждой группе.

Протоколы исследований

Животных выводили из эксперимента передозировкой золетила (“Virbac Sante Animale”, Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50мг/кг. У мышей в возрасте 17-ти суток забирали кожный лоскут в зоне алопеции (межлопаточная область спины) и в пограничной зоне, а также в шейной области и с головы. Также производили определение зоны расшатанных волос, указывающей на переход волос в стадию телогена, с помощью пинцета и дополнительно исследование корней удалённых волос для определения стадии цикла роста волос с помощью лупы с увеличением 10. У мышей в возрасте 1,5 и 2,5 месяцев производили забор кожного лоскута с межлопаточной области спины. После вскрытия брюшной и грудной полостей удаляли тимус и селезёнку.

Тимус и селезёнку взвешивали на аналитических весах («МВ120», «Сартогосм», Россия). Так как мыши контрольной и опытной групп статистически значимо не отличались по массе тела, рассчитывали относительную массу тимуса и селезёнки как отношение их массы к массе тела.

Кусочки тимуса, селезёнки, кожи фиксировали в жидкости Буэна. После стандартной автоматизированной гистологической проводки с помощью гистопроцессора «Tissue-Tek VIP 5 Jr» (“Hygeco”, Франция) кусочки органов заливали в парафин, изготавливали срезы на микротоме «Thermo Scientific Microm HM 340E» (“Microm Gmbh”, Германия). Депарафинированные срезы тимуса, селезёнки и кожи окрашивали гематоксилином и эозином (“Biovitrum”, Россия), 1% раствором толуидинового синего рН 2,0 (“Sigma”, США), в срезах кожи проводили ШИК-реакцию (“Biovitrum”, Россия).