Постнатальный морфогенез органов иммунной системы и кожи потомства самок мышей, подвергшихся иммуностимуляции в ранние сроки беременности (стр. 3 )

Изучение препаратов проводили на световом микроскопе Leica DM2500 (“Leica mycrosystems CMS Gmbh”, Австрия). Морфометрические исследования гистологических препаратов органов выполняли с помощью морфометрических программ “Image Scope M” (“Leica mycrosystems CMS Gmbh”, Австрия). В гистологических препаратах тимуса рассчитывали долю коркового вещества, измеряли ширину субкапсулярного слоя, численность лимфоцитов в мм2 площади среза мозгового и коркового вещества, количество тимических телец в мм2 площади среза мозгового вещества, количество ретикулярных эпителиоцитов, входящих в тимическое тельце и стадии развития тимических телец. В гистологических препаратах селезёнки рассчитывали долю белой пульпы, измеряли ширину маргинальной зоны в мкм, подсчитывали количество клеток в мм2 маргинальной зоны и красной пульпы, процентное содержание в них нейтрофилов, количество мегакариоцитов в мм2. В вертикальных срезах кожи измеряли толщину мальпигиева слоя эпидермиса в мкм, толщину дермы, подсчитывали количество клеток в мм2 среза дермы. В горизонтальных срезах кожи подсчитывали количество волосяных фолликулов и сальных желёз в мм2 среза.

В препаратах, окрашенных толуидиновым синим, выявляли и изучали цитофизиологические характеристики тучных клеток по (2009). Определяли число выявляемых клеток в мм2 среза тимуса, селезёнки, дермы, их средний гистохимический коэффициент (СГК), индекс дегрануляции (ИД) и соотношение степеней дегрануляции.

Для определения субпопуляционного состава лимфоцитов тимуса и селезёнки использовали следующие конъюгаты антител с флюорохромами (“eBioscience, Inc.”) к антигенам мыши: CD3, CD4, CD8, NK1.1, бGalactosylceramide CD1d,  CD19, CD5-FITC, CD23. CD3-позитивные клетки определяли как Т-клетки. В гейте CD3+ определяли содержание Т-хелперов как CD4+CD8--клетки, Т-цитотоксических лимфоцитов как CD4-CD8+, дубльпозитивных CD4+CD8+, а также дубльнегативных CD4-CD8- (в тимусе). Рассчитывали иммунорегуляторный индекс как соотношение долей  Т-хелперов к Т-цитотоксическим лимфоцитам (в селезёнке). Определяли содержание NK-клеток как CD3-NK1.1+-клеток, NKT-клеток как CD3+NK1.1+бGcCD1d+-клеток, В-клеток как CD19+, В1-клеток как CD19+CD5+ клеток, активированных В - и В1-клеток, несущие низкоаффинный рецептор иммуноглобулина Е FcгRII, как CD19+CD23+ и CD19+CD5+CD23+-клеток, соответственно [ и др., 2011]. Определение процентного содержания клеток проводили с использованием проточного цитофлуориметра “Cytomix FC 500” (“Beckman Coulter”). В пробах анализировали не менее 100000 случаев.

Для определения пролиферативной активности ex tempore [ с соавт.,1990] клетки тимуса и селезёнки в количестве 2х105 вносили в 96-луночные планшеты для определения 4-х часовой пролиферации, добавляли 3Н-тимидин 1мкКи/лунку (удельная активность 25 Ки/моль). После инкубации клетки снимали на харвестре, метку просчитывали на в-счетчике (“LKB” Швеция).

Определяли концентрацию ФНО-б, ИЛ-2, ИЛ-10, ТФР-в в супернатантах клеток тимуса и селезёнки, а также ФНО-б в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческих наборов реактивов (“Bender Medsystems”, Австрия).

Абсолютное количество лейкоцитов в крови подсчитывали с помощью гематологического анализатора “Celltac alpha MEK-6400” (“Nikon Kohden”, Япония). Лейкоцитарную формулу определяли подсчётом клеток в мазках крови (не менее 500 клеток в мазке), окрашенных по Романовскому-Гимза.

Определение цитотоксической активности клеток селезёнки проводили на высоко чувствительной к фактору ФНО-б культивируемой клеточной линии фибросаркомы L-929, модифицированным методом, описанным  Baarsh M. et al., 1991. Процент цитолиза просчитывали по формуле: К1/К2 х100%, где К1 – оптическая плотность контрольных, а К2 – опытных образцов.

Статистическую обработку проводили с помощью программы STATISTICA 7.0 (“Statsoft Inc.”, США). Проводили анализ соответствия вида распределения признака закону нормального распределения с использованием критериев Колмогорова-Смирнова, Лиллиефорса, Шапиро-Уилка. Центральные тенденции и рассеяния количественных признаков, имеющих приближенно нормальное распределение, описывали средним значением М и стандартной ошибкой среднего значения m. Сравнение независимых групп по количественному признаку проводили с помощью t-критерия Стьюдента с учетом значений критерия Левена о равенстве дисперсий, критериев Манна-Уитни и ч2. Статистически значимыми различия считали при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Морфофункциональные изменения органов иммунной системы самок мышей после однократной стимуляции иммунной системы в ранние сроки беременности

У самок контрольной группы на 14-ые сутки беременности наблюдали акцидентальную инволюцию тимуса 1-ой стадии. В селезёнке отмечали увеличение размеров органа, уменьшение доли белой пульпы, снижение количества лейкоцитов в красной пульпе и увеличение пролиферативной активности клеток селезёнки (табл. 1), что соответствует литературным данным об изменениях тимуса и селезёнки во время беременности [Kendall M. et al., 2000; Bustamante J. et al., 2008].

Введение Т-клеточного митогена самкам на 7-ые сутки беременности приводило к изменениям морфофункциональных характеристик, как тимуса (табл.1), так и селезёнки (табл. 1). В тимусе наблюдалась акцидентальная инволюция 3-ей стадии, снижение пролиферативной активности тимоцитов (табл. 1), а в селезёнке – значительное увеличение размеров органа и резкое повышение пролиферативной активности клеток (табл. 1).

Выявленные изменения в тимусе и селезёнке после однократного введения Т-клеточного митогена на 7-ые сутки беременности указывали на усиление им процессов, развивающихся в органах иммунной системы во время физиологической беременности. Однократная стимуляция Т-клеточного звена иммунной системы на ранних сроках беременности не нарушала физиологическое течение беременности и не влияла на ее исход.

Табл.1

Морфологические и функциональные характеристики тимуса и селезёнки небеременных самок, интактных беременных  и беременных, стимулированные Кон А самок мышей 14-ые сутки беременности, (M±m)

Показатель	Небеременные самки	Интактные беременные самки	Беременные самки, стимулированные Кон А
Доля коркового вещества тимуса, %	72,86±2,53	78,31±3,53	51,69±5,99*#
Количество тимических телец /мм2 площади мозгового вещества	16,83±2,41	4,85±1,12*	8,38±1,56*#
Кол-во лимфоцитов/мм2 мозгового вещества тимуса	14084,0±990,0	17000,0±1266,0	19133,0±444,0*#
Пролиферативная активность тимоцитов, имп/мин	2846,0±140,0	23319,0±1660,0*	2673,0±135,0#
Масса селезёнки, г	0,13±0,015	0,17±0,02*	0,55±0,05*#
Доля белой пульпы, %	34,80±3,41	22,48±2,14*	24,86±2,56
Кол-во клеток в мм2 красной пульпы	21811,0±552,0	15033,0±662,0*	19500,0±720,0#
Пролиферативная активность клеток селезёнки, имп/мин	1882,0±342,0	4844,0±240,0*	120330,0±6050,0*#

Примечание: * - статистически значимые отличия от группы небеременных самок, # - статистически значимые отличия от группы интактных беременных самок.

Через трое суток после введения Кон А беременным самкам наблюдался повышенный уровень спонтанной выработки цитокинов клетками селезёнки, а дополнительное стимулирование клеток Кон А и ЛПС in vitro не вызывало повышения продукции цитокинов, то есть повышение продукции цитокинов продолжалось в течение нескольких дней. Повышенной уровень пролиферативной активности сохранялся через 7 дней после введения

Таким образом, однократное введение Кон А беременным самкам являлось адекватной моделью изменений в иммунной системе матери, вызванных увеличением продукции цитокинов, наблюдаемым при инфекционных процессах, стрессовых реакциях и др.

Морфофункциональные изменения органов иммунной системы потомства самок мышей, перенесших однократную стимуляцию иммунной системы в ранние сроки беременности, в разные периоды постнатального онтогенеза

Морфофункциональные изменения тимуса

Исследование тимуса потомства мышей опытных групп показало, что его развитие к 17-ти дневному возрасту соответствовало параметрам контрольной группы, таким как относительная масса, доля коркового вещества и ширина субкапсулярного слоя, но отмечалось меньшее содержание лимфоцитов в мозговом веществе и увеличение числа тимических телец, особенно 2-ой стадии (табл. 2). Клетки тимуса потомства мышей опытных групп обладали повышенной пролиферативной активностью. Также наблюдали более высокие темпы дифференцировки лимфоцитов тимуса, о чём свидетельствовало более высокое содержание CD3+-клеток и В1-клеток, играющих важную роль в негативной селекции тимоцитов [Perera J. et al., 2013]. Среди CD3-позитивных клеток процентное содержание дифференцированных CD4+ и CD8+ не отличалось, дифференцирующихся дубльпозитивных было ниже, а дубль-негативных выше, чем в контрольной группе. Однако, отмечалось уменьшение содержания NK - и NKТ-субпопуляций лимфоцитов в тимусе (табл. 3).

К периоду полового созревания тимус мышей достиг максимальных показателей развития. Тимус мышей опытных групп не отличался от тимуса мышей контрольной группы по относительной массе и степени развития коркового вещества. У мышей контрольной группы в субкапсулярном слое наблюдали большое количество клеток с  меньшими размерами ядер и более высоким содержанием гетерохроматина, что по литературным данным характерно для дифференцирующихся лимфоцитов, а не лимфобластов [Yagi H., et al., 1997]. У мышей опытных групп ширина субкапсулярного слоя была меньше, но в нем содержалось большее количество лимфобластов с крупными ядрами с низким содержанием гетерохроматина. В мозговом веществе содержание лимфоцитов не снижено по сравнению с предыдущим сроком исследования и равно значениям контрольной группы. Количество тимических телец не отличалось от значений контрольной группы, за исключением группы «активированные клетки», но происходило увеличение содержания тимических телец 4-ой стадии развития (табл. 2). Пролиферативная активность клеток тимуса снижена по сравнению с предыдущим сроком исследования, но была статистически значимо выше.