Чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, выделенных в краснодарской краевой клинической больнице №2 (стр. 4 )

Этот этап заключается в изучении характера роста на питательной среде, интерпретации визуальной характеристики выросших колоний и отборе их для получения чистой культуры и первичной идентификации. Учитывают, прежде всего, морфологическую характеристику колоний, пигментообразование, наличие специфического запаха (например, у бактерий рода Citrobacter), изменение цвета среды. Ведущее значение имеет дифференциация по окраске изолированных колоний, которую определяют особенности метаболизма бактерий в отношении дифференцирующих субстратов питательной среды. Таким субстратом в большинстве случаев является лактоза. Соответственно и колонии, образованные бактериями, не расщепляющими ее, выглядят бесцветными или имеющие оттенок цвета самой среды. Такие колонии подлежат первоочередному отбору (отсеву), так как могут быть образованы патогенными энтеробактериями (шигеллами, сальмонеллами и т. д.) и условно-патогенными энтеробактериями (УПЭ) (гафния, провиденция, серрация и др.). Многие штаммы УПЭ способны ферментировать лактозу с различной интенсивностью и образуют разной степени окрашенные колонии. Поэтому для дальнейшего изучения следует отсевать не менее 3-5 колоний каждого вида, особенно при первичной этиологической расшифровке диарейных заболеваний в очагах [Гиссенс, 2001].

Методика взятия колоний для выделения чистой культуры проста, но имеет большое значение. Дело в том, что используемые питательные среды (особенно высокоселективные) действуют, в основном, бактериостатически, и микробы-спутники, не развиваясь на них, сохраняют жизнеспособность, а значит, представляют опасность загрязнения колоний искомых энтеробактерий. Колонию следует снимать тонкой бактериологической петлей прикосновением к центру колоний. Недопустимо охлаждение петли о визуально свободную от роста поверхность среды. Отобранные колонии отсевают на многотестовые (комбинированные) среды для накопле­ния чистой культуры и ее предварительной идентификации [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

2.4 Методы идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae

Со среды Эндо снимают подозрительные колонии и засевают уколом в столбик среды Олькеницкого. После 24-часовой инкубации при 37 єC делают предварительное заключение о родовой принадлежности выделенных культур [Зубков, 2002].

На поверхности среды Олькеницкого наблюдается влажный однородный рост без пигментообразования. По изменению окраски столбика среды учитывают способность ферментировать глюкозу, а по изменению окраски скошенной части ферментировать лактозу. Для определения родовой принадлежности проводят:

- Определение подвижности в полужидкой среде Кларка. При росте микроорганизмов по ходу укола судят об отсутствии подвижности;

- Определение использования цитрата.

Посев производят 18-часовой культуры на среду Симмонса. Инкубируют при 37 єC 18–20 часов. Рост культуры и изменение окраски в синий цвет свидетельствуют о положительной реакции. Кишечная палочка в отличие от других кишечных бактерий роста не дает.

- Определение декарбоксилаз аминокислот. Посев производят в среду с аминокислотами (лизин, орнитин, аргинин) и контрольную среду, вносят стерильное вазелиновое масло, инкубируют при 37 єC  24 часа. Затем добавляют 4–5 капель 10 % раствора хлорида железа (3). Появление интенсивно-зеленой окраски свидетельствует о положительной реакции;

- Видовая дифференциация на среде Гисса по реакциям «пестрого ряда» [Зубков, 2002].

Также идентификация микроорганизмов проводилась при помощи времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI). Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ – (от англ. MALDI, Matrix Assisted Laser Desorbtion/Ionization) – десорбционный метод «мягкой» ионизации, обусловленной воздействием импульсами лазерного излучения на матрицу с анализируемым веществом. Матрица представляет собой материал, свойства которого обусловливают понижение деструктивных свойств лазерного излучения и ионизацию анализируемого вещества. В баклаборатории ГБУЗ ККБ №2 используют метод  МАЛДИ масс-спектрометрии по белковому профилю бактерий [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

2.5 Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотическим препаратам

В лабораториях лечебных учреждений чаще применяется диско-диффузионный метод (ДДМ) определения чувствительности, основанный на способности антибактериального препарата диффундировать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганизмов, посеянных на поверхности агара.

Для определения чувствительности ДДМ используют плотную питательную среду и стандартизированные диски, изготовленные в специализированных лабораториях. При измерении зон задержки роста ориентируются на зону полного подавления видимого роста [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Помимо ДДМ чувствительность микроорганизмов определяют при помощи системы для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact, в основу которой положен метод серийных разведений. Автомат производит разведение культуры бактерий и засевает им специальные кассеты с уже нанесенными антибиотиками. После 7-8 часов инкубации при 37 єC аппарат передает данные в компьютер в виде таблицы, на которой отображается устойчивость к антибиотикам [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Для определения чувствительности выделенных микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом применялись диски производства НИЦФ, Санкт-Петербург, компании Biomerieux, Becton Dikinson, Франция, диски с нитроцефепином для определения наличия бета-лактамаз производства Челябинского НИИИФ. Для идентификации микроорганизмов используется также система для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact производства компании «Био-мерье», Франция [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Список антибиотиков, применяемых при ручном методе определения чувствительности [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004]:

Антибиотик	Группа
нетилмицин	аминогликозиды
азитромицин	макролиды
ампициллин	пенициллины
левофлоксацин	фторхинолоны
моксифлоксацин	фторхинолоны
цефтазидим	цефалоспорины 3

Список антибиотиков, применяемых на системе для автоматической идентификации и определения чувствительности к антимикробным препаратам VITEK 2 Compact исключительно для определения устойчивости штаммов  Enterobacteriaceae [Определение чувствительности микроорганизмов…, 2004].

Антибиотик	Группа
амикацин	аминогликозиды
гентамицин	аминогликозиды
нетилмицин	аминогликозиды
триметоприм/сульфаметоксазол	диаминопиримидин/сульфаниламид
имипенем	карбапенемы
меропенем	карбапенемы
нитрофурантоин	нитрофураны
амоксициллин/клавуланат	пенициллины
ампициллин	пенициллины
пиперациллин	пенициллины
ципрофлоксацин	фторхинолоны 1
цефазолин	цефалоспорины 1
цефотаксим	цефалоспорины 3
цефтазидим	цефалоспорины 3
цефепим	цефалоспорины 4

3 Чувствительность к антибиотикам энтеробактерий, выделенных в Краснодарской краевой клинической больнице №2

3.1 Устойчивость к антибиотикам штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных от больных урологического отделения ГБУЗ ККБ №2

Нами совместно с сотрудниками баклаборатории проводились исследования этиологии гнойно-септических осложнений в урологическом отделении ГБУЗ ККБ №2. Определение устойчивости к антибиотикам выделенных культур было нашей основной задачей. Всего было выделено 722 пробы, содержащие штаммы Enterobacteriaceae (таблица 1).

Таблица 1 – Частота обнаружения микроорганизмов в пробах клинического материала от больных, январь 2013 года – сентябрь 2014 года.

Биоматериал	Общее число проб	Число проб, содержащих микроорганизмы	Число проб, содержащих штаммы семейства Enterobacteriaceae (давших рост при посеве)
моча	4358	1875	693
отделяемое ц/к	444	329	29
всего	4802	2204	722

В таблице 1 показано, что большая часть проб была выделена из мочи пациентов (96 % проб). На долю проб, содержащих биоматериал из выделений цервикального канала, приходится всего 4 %.

Всего в отделении с января 2013 по сентябрь 2014 года выявлено 70 представителей различных семейств, из них 20 относятся к семейству Enterobacteriaceae.

Остальные микроорганизмы относятся к неферментирующим бактериям (рода Acinetobacter, Pseudomonas), бактериям родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus и дрожжеподобным грибам (род Candida).

Перечень выделенных в урологическом отделении бактерий, принадлежащих семейству Enterobacteriaceae: Citrobacter braakii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Enterobacter aerogenes, Enterobacter asburiae, Enterobacter cloacae, Enterobacter cloacae ssp. cloacae, Enterobacter koberi, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae ssp. oxytoca, Klebsiella pneumoniae ssp. pneumoniae, Kluyvera ascorbata, Morganella morganii, Morganella morganii ssp. morganii, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Serratia liquefaciens group, Serratia marcescens.