Занятие 1. Определение цитотоксической и противоопухолевой активности биологически активных веществ (БАВ) (стр. 2 )

Использование клеточных культур для изучения действия БАВ имеет несомненнное преимущество при работе с радиоактивной меткой, так как на метаболизм клетки не влияют клетки других органов. Об изменениях, проишедших в клеточных культурах под действием БАВ, судят по изменению скорости синтеза ДНК или, если клетка погибает, по выходу из неё радиоактивной метки.

Мерой скорости роста клеток является интенсивность синтеза ДНК, которая оценивается обычно по включению тимидина, меченного тритием или радиоуглеродом. Вследствие очень высокой специфичности тимидина как предшественника, а также из-за чрезвычайно низкого уровня метаболической активности ДНК, радиоактивный тимидин очень избирательно метит клетки, находящиеся в стадии синтеза этой нуклеиновой кислоты. Наиболее часто используют тимидин, меченый тритием. Так, водно-спиртовый раствор 1-метил-3Н-тимидина, выпускаемый изотопной промышеленностью Российской Федерации, имеет высокую удельную активность, достаточно учтойчив и при комнатной температуре в водном растовре в стерильных условиях может сохраняться длительное время.

Ориентировочные оценки количества меченого соединения, необходимого для поглощения клетками, можно рассчитать исходя из того, что в среднем одна клетка за минуту потребляет 1,7 ? 10-17 грамм-молекулы 3Н-тимидина. Молярную концентрацию (К) 3Н-тимидина рассчитывают по формуле:

К = 1,7 ? 10-14 Nt/V,

где N - число клеток, t - время в минутах, V - используемый объём в мл.

Наример, в суспензионной культуре, где обычная плотность составляет 106 клеток в 1 мл, при культивировании в течение 3 часов: К = 1,7 ? 10-14 ? 106 ? 180 ? 3 ?10-6 М. Для того чтобы концентрация тимидина во время опыта не опускалась ниже пороговой, берут концентрацию на порядок выше. При этом следует иметь ввиду, что при концентрации 10-4 М тимидин подавляет пролиферацию клеток.

Введение метки производится путём инкубирования клеток в присутствии радиоактивного тимидина в течение времени, достаточного для получения высокого уровня счёта. Скорость включения радиоактивного индикатора зависит от типа культуры, поэтому время инкубирования приводится в описаниях конкретных методов.

Радиоактивность обнаруживают по излучению, характерному для каждого изотопа. Хром-51 и иод-125 испускают ?-кванты, которые легко зарегистрировать в гамма-счётчике. Из-за высокой проникающей способности этого излучения, к виду пробы (жидкость, порошок и т. п.) и материалу счётного флакона никаких специальных требований не предъявляется. Гораздо сложнее определять мягкое ?-излучение трития и радиоуглерода. Атом радиоуглерода в каждом акте распада испускает электрон с энергией от 0 до 155 КэВ, так что весь 14С-образец дает сплошной спектр электронов со средней энергией Е = 50 КэВ и максимальной Еmax = 155 КэВ. ?-спектр трития имеет соответственно Еmax = 18 КэВ и E = 5,6 КэВ, что находися на грани возможностей регистрации обычными ядерно-физическими методами. Средний пробег электрона 3Н в воде (ткани) составляет около 1 мкМ. Это предъявляет особые требования к детектору (счётчику) ?-излучения. Наиболее подходящим из них при массовых измерениях является жидкостно-сцинтилляционный счётчик (ЖСС). Принцип действия ЖС-счётчик состоит в поглощении ?-излучения метки, помещённой в сцинтиллятор, и последующем преобразовании её в свет сцинтилляции, который регистрируется фотоэлектронным умножителем (ф. э.у.). Счёт радиоактивности можно осуществить введением меченого препарата в ЖС-раствор либо на фильтрах.

Суспензионную культуру клеток чаще осаждают на фильтрах, промывают холодным физраствором и осаждают кислотонерастворимую фракцию 5%-ным раствором холодной трихлоруксусной кислоты (ТХУ), отмывая свободную, не включённую метку последовательными сменами промывной жидкости (например, 5%-ным раствором ТХУ). Затем фильтры промывают этанолом, эфиром и сушат. Промывка двумя последними растворителями предназначена для удаления следов воды, которая препятствует смачиванию фильтра толуольным сцинтиллятором (4 г/л 2,5-дифенилоксазола (ППО) + 0,4 г/л 1,4-бис-2-(5-фенилоксазолин)-бензола (ПОПОП) в толуоле), что может привести к уменьшению эффективности счёта. Сухой фильтр в жидком сцинтилляторе выглядит полупрозрачным и однородным.

Фильтры, используемые для задержания ДНК, могут быть из толстой фильтровальной бумаги (например, «Whatmann 3MM»), стекловолокнистые - типа GF/A-C c размером пор 0,45-1,2 мкм или мембранные из нитроцеллюлозы («Сынпор», Чехословакия; «Millipore», США). Задерживание препарата на фильтре обусловлено механическими причинами или как в случае с мембранными фильтрами молекулярной сорбцией однонитевых молекул ДНК. Между расположением препарата на бумажных, стеклянных и мембранных фильтрах имеются существенные различия. На мембранном - материал располагается на поверхности, что облегчает его контакт со сцинтиллятором. Это имеет немаловажное значение при работе с ?-радиоактивностью и обеспечивает максимальный «выход активности». В случае бумажных стеклянных фильтров осадок проникает на глубину, что затрудняет доступ сцинтиллятора к радиоактивному веществу. Эффективность выхода радиоактивности по тритию на стекловолокнистом фильтре достигает 10%, на бумажном - 2%.

Неоправдано стремление любыми путями увеличить эффективность регистрации радиоактивности. Важно, чтобы величина регистрации не изменялась от пробы к пробе. Применяемой радиоактивности обычно достаточно, чтобы получить надёжный результат. В относительных измерениях, когда интерес представляет распределение радиоактивности в пределах серии, необходимо, чтобы образцы были однородны по объёму, окраске и составу. На практике почти всегда производятся относительные определения по числу  регистрируемых отсчётов (имп./мин). Абсолютные измерения (рас./мин) радиоактивности значительно сложнее и возможны лишь на микропроцессорных счётчиках, в которых встроенный компъютер (т. н. DPM-модуль) автоматически определяет факторы, снижающие эффективность регистрации (?), и вводит соответствующие поправки  с учётом тушения по методу отношения каналов, внешнему стандарту, счёта эталонной радиоактивности, отбраковывает пробы с хемилюминесценцией и т. п. Подходящим для этих целей является модель программируемого счётчика с DPM-модулем «Mark-III», CША. Если есть возможность абсолютных измерений, их всегда следует предпочесть относительным. Абсолютные определения радиоактивности позволяют не только снизить требования к однородности и виду проб, но и делают возможным сравнение самых различных серий, в том числе выполненных в разное время и разными методами.

Экспериментальная часть.

Реактивы и приборы.

Лабораторные животные (мыши), опухолевые клетки; 0,5% суспензия эритроцитов; суспензия лифоцитов селезёнки (спленоциты); клетки внутриперитониального экссудата (макрофаги); среда 199; телячья эмбриональная сыворотка; гепарин; пенициллин; стрептомицин; гентамицин; D-глутамин; буфер НЕРЕS; фитогемагглютинин (ФГА); конканавалин А; трихлоруксусная кислота (ТХУ) - 5%-ный раствор; физиологический раствор - 0,9% NaCl; трипановый синий - 0,2% раствор в физиологическом растворе NaCl; эозин - 0,5% раствор в физиологическом растворе NaCl; 5%-ная уксусная кислота; пикриновая кислота; метиленовый синий; пенициллиновые флаконы; мерные пробирки и стаканы; предметные и покровные стёкла; шприцы и иглы для инъекций; чашки Петри разного размера; небольшие стаканы и бюксы; пинцеты и глазные ножницы; фильтровальная бумага; медицинский спирт; стеклянный гомогенизатор - (100 ? 15 мм); герметичный эксикатор для инкубирования клеток; микропипетки автоматические на 20, 200 и 1000 мкл; фильтровальная бумага; диски из толстой фильтровальной бумаги «Whatman-3MM»; счётная камера Горяева; ламинарный бокс; центрифуга; микроскоп; термостат для культивирования клеток (+37оС); жидкостно-сцинтилляционный ?-счётчик.

Определение цитотоксической и гемолитической активности БАВ.

Проведение исследования.

       При изучении цитотоксического действия препаратов в условиях in vitro в качестве тест-системы используют первичные суспензионные культуры асцитных опухолевых клеток Эрлиха, полученные из Российского научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков РАМН (Москва). Эти клетки легко выделяются и используются в качестве экспериментальной модели без необходимости проведения сложной процедуры выделения, которая может повредить клеточные мембраны.

Белых беспородных мышей (18 - 22 г) на 7 - 9 день после инокуляции опухоли подвергают эвтаназии методом цервикальной дислокации, стерилизуют протиранием 70%-ным этиловым спиртом, растянув за конечности, брюшком вверх, булавками прикрепляют к столику для вскрытия. Тупоконечными острозаточенными ножницами делают срединный разрез от нижней челюсти до лобковой кости. При этом кожу придерживают хирургическим пинцетом, затем оттягивают пальцами по обе стороны разреза и прикалывают к поверхности столика. В стерильных условиях ламинарного бокса стерильным шприцем набирают из брюшной полости асцитную жидкость. Полученную асцитную жидкость (1 мл), содержащую опухолевые клетки, отмывают дважды центрифугированием при 800 об./мин (120 ? g) 4 - 5 объёмами раствора Хенкса или физиологического раствора. После отмывания осадок ресуспендируют в инкубационной среде (физрастворе, растворе Хенкса или в средах 199 и RPMI-1640) для получения клеточной суспензии в конечной концентрации 1-2 ? 106 клеток в 1 мл. Оценку количества опухолевых клеток в суспензии производят в заданном объёме с помощью камеры Горяева.

       Шлифованное покровное стекло помещают на предметное стекло камеры Горяева так, чтобы покрыть заштрихованные области, и слегка прижимают до появления колец Ньютона. Это приводит к образованию камеры с фиксированным объёмом, поскольку края предметного стекла подняты над заштрихованной поверхностью ровно на 0,1 мм. Каплю клеточной суспензии, содержащую примерно 1-2 млн. клеток в 1 мл, помещают на краю покровного стекла так, чтобы суспензия под действием капиллярных сил проникла в камеру. Пространство между дном камеры и покровным стеклом должно быть полностью заполнено, но так, чтобы взвесь не вытекала. Камеру примерно минуту оставляют на горизонтальной поверхности для оседания клеток. Под микроскопом с объективом ?10 или ?40 подсчитывают не менее 200 клеток. Траектория просмотра слева направо. Учитывают все клетки, расположенные внутри большого квадрата, а также касающиеся его левой и верхней сторон.