Занятие 1. Определение цитотоксической и противоопухолевой активности биологически активных веществ (БАВ) (стр. 4 )

       Из лимфоцитов образуюся и плазматические клетки - главный производитель антител и ?-глобулинов. Их цитоплазма занимает значительную часть клетки, она заполнена структурами, участвующими в интенсивном белковом синтезе, и прежде всего - ?-глобулинов.

       Макрофаги представляют собой большие клетки, играющие важную роль в формировании клеточного иммунитета. Часть их «путешествует» по кровеносной системе организма, но многие «сидят» на месте - в селезёнке, лимфоузлах, печени и других тканях. Все макрофаги образуются из общей клетки-предка - кроветворной стволовой клетки костного мозга. Основная функция макрофагов - очищение организма от бактерий, вируных частиц, продуктов распада собственных тканей, токсинов и т. д. Для поглощения и переваривания чужеродных веществ в макрофаге существует специальный аппарат, состоящий из пузырьков лизосом, заполненных высокоактивными ферментами, расщепляющими белки, жиры, углеводы и нуклеиновые кислоты. По своему внешнему виду макрофаги могут сильно отличаться друг от друга, однако их объединяет способность к поглощению (фагоцитированию) разнообразного материала.

       Макрофаги, также как и В-лимфоциты, фолликулярные отростчатые клетки лимфоузлов и селезенки, клетки Лангерханса, М-клетки в лимфатических фолликулах пищеварительного тракта, дендритные эпителиальные клетки вилочковой железы, относятся к Аг-представляющим клеткам. Эти клетки захватывают, процессируют и представляют Аг (эпитоп) на своей поверхности другим иммунокомпетентным клеткам.

       К центральным органам иммунитета относят костный мозг и тимус (вилочковую железу), к периферическим - лимфоидную ткань организма: периферические лимфоузлы, селезёнку, пейеровы бляшки кишечника, нёбные миндалины и другие лимфоидные органы.

Клеточные факторы иммунитета: Т - и В-лимфоциты.

       К иммунокомпетентным клеткам относятся Т - и В-лимфоциты, NК-клетки и антиген-представляющие клетки. Выделяют две основные популяции лимфоцитов: Т - и В-лимфоциты. Их родоначальниками являются стволовые лимфоидные клетки, в последующем дифференцирующиеся в тимусе в Т-лимфоциты, а костном мозге - в В-лимфоциты (в этих органах происходит их созревание).

       Тимус прямо «нафарширован» лимфоцитами. Его можно рассматривать как своеобразный «штаб» лимфоидной армии. Откуда берутся лимфоциты в тимусе? Они поступают в него из костного мозга. Из общего «пула» стволовых кроветворных клеток формируются стволовые лимфоидные клетки - предшественники Т-клеток. Последние мигрируют в тимус, где под влиянием гормона (тимозина) и происходит их окончательная дифференцировка в зрелые Т-лимфоциты. В тимусе клетки на 90-95% представлены Т-лимфоцитами.

       В-лимфоциты формируются в костном мозге независимо от тимуса, участвуют в выработке антител, созревают в костном мозге или в лимфоидной ткани, ассоциированной прежде всего с кишечником и бронхами. В-система иммунитета имеет непосредственное отношение к выработке иммуноглобулинов, ответственных за иммунные реакции организма. Среди В-клеток выделяют три основные группы клеток В-эффекторы, В-хелперы и В-супрессоры. В-клетки сами по себе не способны распознавать чужеродные антигены: без Т-клеток они беспомощны, но, получив информацию о проникших в ткани антигенах, в процессе деления превращаются в плазматические клетки, продуцирующие антитела, соединяющиеся с антигенами. 

       В состав Т-лифоцитарной системы входят клетки, выполняющие эффекторную и регуляторную функции. Эффекторная функция Т-лимфоцитов - специфическая цитотоксичность в отношении чужеродных клеток. Главными исполнителями этой функции являются цитотоксические Т-лимфоциты (Т-лимфоциты-киллеры), имеющие специфические рецепторы к антигенам чужеродных (или дефектных своих) клеток. Регуляторную функцию выполняют Т-хелперы и Т-супрессоры. Т-хелперы усиливают, а Т-супрессоры угнетают иммунный ответ.

       NK-клетки, которые не имеют поверхностных детерминант, характерных для Т - и В-лимфоцитов, убивают ауто-, алло - и ксеногенные опухолевые и инфицированные клетки.

       Т - и В-лимфоциты после их образования располагаются в различных участках лимфатической системы, постоянно циркулируя по кровеносным и лимфатическим сосудам. В ответ на антигенный стимул происходит активация и пролиферация Т-лимфоцитов с преимущественным размножением клона клеток, имеющих рецепторы к внедрившимся антигенам. Зрелые В-лимфоциты (плазматические клетки) под влиянием антигена и при помощи Т-лимфоцитов и макрофагов синтезируют иммуноглобулины (антитела), специфические к данному антигену. Продукция антител происходит в периферических лимфоидных органах, в местах внедрения в организм антигена. Клетки, продуцирующие антитела классов G, M, находятся преимущественно в лимфоузлах и селезёнке, а А, Е - в лимфоидных образованиях слизистых оболочек.

       Морфологически Т - и В-лифоциты отличаются тем, что на поверхности В-лимфоцитов выявляются микроворсинки, на Т-лифоцитах их нет. Рецепторами В-лимфоцитов являются антитела (структуры иммуноглобулиновой природы), взаимодействиующие с одним-двумя конкретными антигенами. Т-клетки несут на своей поверхности маркеры-антигены, которые объединены в кластеры дифференцировки (СD). СD4-антиген  - маркер индукторных хелперных Т-клеток. Т-хелпер (Т4+клетка) индуцирует дифференцировку В-лимфоцитов. СD8-антиген - маркер супрессорных или цитотоксических Т-клеток. Т8+ клетки ингибируют пролиферацию лимфоцитов. Т-клетки выступают в роли первичных регуляторов В-клеток и моноцитов крови, тканей. Это достигается либо посредством выделения ими гуморальных факторов - цитокинов (интерлейкинов и лимфокинов), либо путём прямого контакта с В-лимфоцитами.

Взаимодействие клеток при иммунном ответе.

       В гуморальном иммунном ответе участвуют макрофаги (Аг-представляющие клетки), Т-хелперы и В-лимфоциты. Рецептор Т-хелпера распознает антигенную детерминанту (эпитоп) вместе с молекулами МНС II класса, выставленные на поверхности Аг-представляющей клетки. В молекулярном взаимодействии участвует дифференцировочный Аг Т-хелпера СD4. В результате подобного взаимодействия Аг-представляющая клетка секретирует ИЛ-1, стимулирующий в Т-хелпере синтез и секрецию ИЛ-2, а также синтез и встраивание в плазматическую мембрану того же Т-хелпера рецепторов ИЛ-2. ИЛ-2 стимулирует пролиферацию Т-хелперов. Отбор В-лимфоцитов производится при взаимодействии Аг с Fab-фрагментами IgM на поверхности этих клеток. Эпитоп этого антигена в комплексе с молекулой МНС II класса узнает рецептор Т-хелпера, после чего Т-лимфоцит секретирует цитокины, стимулирующие пролиферацию В-лимфоцитов и их дифференцировку в плазматические клетки, синтезирующие АТ против данного Аг.

Клеточный иммунный ответ характеризуется пролиферацией иммунокомпетентных клеток, реагирующих с Аг в комплексе с молекулой МНС I класса на поверхности чужеродных клеток или эндогенными иммуногенами своих дефектных клеток также в комплексе с молекулой МНС I. В клеточном иммунном ответе участвует цитотоксический Т-лимфоцит. Рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов связывается с антигенной детерминантой в комплексе с молекулой МНС I класса на поверхности вирус-инфицированной или опухолевой клетки. В молекулярном взаимодействии участвует дифференцировочный Аг цитотоксического Т-лимфоцита CD8. После связывания молекул взаимодействующих клеток цитотоксический Т-лимфоцит убивает клетку-мишень. Секретируемый Т-хелперами ИЛ-2 стимулирует пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов.

Экспериментальная часть.

Получение суспензии макрофагов из перитониального экссудата для изучения цитостатической активности веществ, опосредованной макрофагами.

       Перитониальный экссудат богат клетками макрофагального ряда (до 70%). При постановке многих иммунологических экспериментов необходимо иметь только макрофаги, без примеси лимфоцитов и других клеток. Клетки макрофагального ряда в отличие от лимфоцитов и других клеток обладают способностью прилипать с стеклу, и это свойство их может быть использовано для получения чистой взвеси макрофагов. Для возможно большего выхода клеток в брюшную полость, мышам за двое сутокдо получения перитониального экссудата вводят в/б 2 мл 2% растовра пептона в дистиллированной воде. Пептон является раздражителем для брюшины и стимулирует накопление клеток в брюшной полости, при этом доля макрофагов в клеточном экссудате возрастает до 80%.

       Культивирование активированных испытуемым препаратом макрофагов с опухолевыми клетками-мишенями может привести к их гибели (цитотоксический эффект) или к нарушению клеточного метаболизма (цитостатичсекий эффект). Ингибирование метаболизма опухолевых клеток чётко коррелирует со снижением интенсивности синтеза ДНК. Для выявления и количественной оценки цитостатического эффекта определяют количество включённого в ДНК меченого тимидина.

Проведение исследования.

Для получения макрофагов в брюшную полость мышей вводят определённое количество исследуемого вещества в 2 мл физиологического раствора. Группы опытных и контрольных животных составляют не менее 5 особей в каждой. Контрольным животным вводят только по 2 мл физраствора. Через определённые интервалы времени после инъекции мышей подвергают эвтаназии путём цервикальной дислокации, фиксируют на доске и в перитониальную полость вводят по 3 мл среды с воздухом, отличающейся от культуральной только отсутствием сыворотки. Затем в течение 2-3 минут проводят массаж брюшной полости и шприцом отбирают перитониальные экссудаты. Экссудаты переносят в чашки Петри, после чего инкубируют при 37°С в течение 1 часа в атмосфере влажного воздуха, содержащего 5% СО2. Не прилипшие клетки снимают с чашек Петри путём трёхкратного промывания культуральной средой. Популяцию прилипших макрофагов снимают резиновым скребком. Жизнеспособность клеток определяют с помощью трипанового синего, взятого в отношении 1:1 к клеточной суспензии. Она должна составлять не менее 95%.

Опухолевые клетки асцитной карциномы Эрлиха извлекают шприцом из перитониальной полости мыши-опухоленосителя и суспендируют в культуральной среде. Концентрацию клеток и их жизнеспособность определяют как приведено в задании 1.