Занятие 1. Определение цитотоксической и противоопухолевой активности биологически активных веществ (БАВ) (стр. 1 )

Занятие 1. Определение цитотоксической и противоопухолевой активности биологически активных веществ (БАВ)

Теоретическая часть

Изыскание новых противоопухолевых веществ - сложный многоступенчатый процесс, важным этапом которого является первичный отбор. Первичный скрининг антибластических препаратов подразумевает выявление биологически активных веществ из множества соединений как природного происхождения, так и полученных путём химического синтеза. Методы первичного отбора противоопухолевых соединений должны обладать большой чувствительностью к обнаружению канцеростатиков, быть по возможности, простыми и экономичными, в короткие сроки давать предварительную объективную оценку исследуемым веществам.

Знание механизмов действия препаратов на опухолевые и нормальные клетки способствует направленному созданию новых лекарственных форм с целью ослабления побочного действия на организм в целом. В качестве примера может служить применение противоопухолевых антибиотиков, заключенных в липосомы.

Интересные и полезные сведения об изучаемых веществах можно получить в результате испытания их цитотоксического эффекта in vitro. Ограничивающим фактором при этом является лишь их растворимость.

Известно много различных систем in vitro используемых для испытания противоопухолевых средств. Однако, наиболее ценными в этом плане нужно признать краткосрочные и стационарные культуры опухолей животных и человека. Подобные системы используются главным образом для прескрининга противоопухолевых препаратов. При этом около 80-85% соединений, проявляющих противоопухолевую активность in vivo, отбираются в системах опухолевых клеток in vitro.

Однако, ценность этих исследований состоит прежде всего в возможности получения дополнительной информации о механизме действия изучаемых веществ. Так, наличие цитотоксического эффекта in vitro свидельствует о прямом действии препарата на опухоль. По величине дозы, вызывающей определённый эффект (например, ЕД50) in vitro, можно судить о концентрации препарата, которую необходимо создать в опухоли in vivo для подавления её роста исследуемыми препаратами. При прескрининге в большинстве случаев активными признаются вещества, ЕД50 которых не превышает 100 мкг/мл.

Экспериментальные животные

Современный уровень развития биоорганической химии требует проведения экспериментальных исследований с использованием контролируемого в генетическом отношении материала. Таким материалом служат чистолинейные или инбредные животные. Особенностью инбредных животных является их гомозиготность, которая обеспечивает генетическую тождественность всех особей в пределах определённых групп (линий). В природных условиях чистых линий животных не существует. Они выведены человеком и представляют собой искусственную популяцию.

В биологических испытаниях наиболее широко в качестве экспериментальных животных используют мышей, крыс, кроликов, морских свинок, хомячков, реже птиц, собак, обезьян. С генетической точки зрения все лабораторные животные могут быть разделены на три типа: беспородные или стихийно скрещиваемые, рандомбредные и инбредные или чистолинейные.

Беспородные, случайно скрещиваемые животные характеризуются большой генетической, а, следовательно, биохимической, иммунологической и т. д. разнородностью. Беспородные животные из разных питомников резко отличаются по своим характеристикам.

Рандомбредные животные. Рандомбрединг - система контролируемого скрещивания животных с целью поддержания максимальной генетической разнородности с сознательным исключением какой-либо селекции. Метод рандомизации способствует поддержанию в популяции максимальной генетической гетерогенности.

Инбредные, чистолинейные животные. Для выведения таких животных используют метод имбридинга (близкородственного скрещивания). Сущность метода заключается в строгой селекции, отборе животных с целью получения генотипически однородных гомозиготных особей и содержания их в идентичных условиях. Данным способом удалось вывести линии мышей, крыс, морских свинок хомяков, цыплят и других животных. Наиболее распространёнными линейными животными, используемыми в практике биологических испытаний, являются мыши. Для получения новой линии мышей необходимо провести близкородственное скрещивание в течение 20-40 поколений. В результате такого приёма удаётся получить потомков, которые становятся гомозиготными по всем основным признакам, то есть тождественны между собой как однояйцевые близнецы. Животные гомозиготные по всем основным признакам называются линейными или инбредными, им даётся обозначение линии.

Если во время выведения линий, когда ещё не достигнута высокая гомозиготность, животных разделить на две или более независимо поддерживаемые популяции, то их потомки будут отличаться по ряду характеристик. Такие популяции животных называют сублиниями. Например, мыши сублинии С57BL/10 и С57BL/6 между собой похожи, но отличаются по генам тканевой совместимости (кожа, пересаженная между мышами этих сублиний, отторгается).

Получение клеток и их культивирование.

Главное преимущество культивируемых клеток, которые используются для биоиспытаний, - это возможность прижизненного наблюдения клеток с помощью микроскопа. Различают первичные культуры и клеточные линии. Первичная культура - это культура, полученная непосредственно из организма. Она считается таковой до первого пересева (пассажа), после чего становится клеточной линией. Она представляет собой гомогенную популяцию генетически однородных клеток, растущих в постоянных условиях.. Если клеточная линия происходит из единичной клетки, то её называют клоновой, или клоном. Клеточные линии могут иметь ограничеснный срок жизни in vitro, а могут размножаться in vitro неограниченно долго. В последнем случае они называются постоянными. Все постоянные клеточные линии в отличие от культур нормальных клеток с ограниченным сроком жизни - трансформированные. Процесс размножения клеток, приводящий к увелечению их численности, принято называть пролиферацией, т. е. термины «пролиферация» и «размножение» употребляются как синонимы.

В условиях, обеспечиающих постоянство параметров среды и нормальное течение внутриклеточных процессов, в популяции культивируемых клеток вопроизводятся регулярные клеточные циклы, т. е. идёт процесс деления клетки и синтеза ДНК с характеристиками, присущими данной клеточной линии ( в пределах 10-30 ч). При этом жизнеспособность клеток оценивают по окраске специальными красителями, например эозином или трипановой синью. Способность клеток синтезировать ДНК проверяется по включению в ядра клеток радиоактивного тимидина: если к среде культивирования на длительное время (обычно 4 ч или более) добавить меченый тимидин, то через определённый срок ядра всех клеток должны содержать большое количество метки. Используя импульсную (20-60 мин) метку тимидином, можно определить долю клеток, находящихся в данный отрезок времени на стадии синтеза ДНК. Основной показатель, по которому определяется положение клетки в ходе цикла, - количество ДНК. Принадлежность к G1-периоду характеризуется нереплицированным, пресинтетическим (для нормальных клеток - диплоидным) количеством ДНК; к S-периоду - переменным, промежуточным, синтезируемым количеством ДНК, к G2-периоду - полностью удвоенным, реплицированным (рис. 1).

Рис. 1. Клеточный цикл

Для анализа активности противоопухолевых веществ, действие которых направлено, в первую очередь, на биосинтез ДНК, наиболее удобен метод проточной флуориметрии, позволяющий быстро получать гистограмму распределения клеток по количеству ДНК и, таким образом, сразу рассчитывать на какой фазе клеточного цикла произошло блокирование её синтеза. Всё сказанное выше учитывается в процессе скрининга противоопухолевых веществ с использованием различных линий опухолевых клеток, а результаты оцениваются относительно контрольных проб, в которые вводят только растворитель. При этом главным направлением использования клеточных культур для скрининга противоопухолевых соединений являются первичный отбор и изучение их механизма действия на клеточном уровне.

Культуральные среды.

Культуральная среда должна обеспечивать клетки необходимыми питательными веществами. В настоящее время пользуются готовыми синтетическими культуральными средами, имеющимися в продаже. Среды составляются на основе сбалансированных буферных солевых растворов (СБСР), которые помимо снабжения клеток необходимыми ионами, важны также для поддержания осмотического баланса. В некоторых случаях в сбалансированный солевой раствор добавляется глюкоза. Наибольшее использование получили СБСР Эрла, Хэнкса и специальный СБСР, предложенный Иглом для суспензионных культур. Весьма важно поддерживать правильное значение рН культуральной среды в диапазоне между 7,2 и 7,5, что достигается обычно с помощью системы бикарбонат/СО2. При концентрации СО2 в воздухе 5% эта система обеспечивает рН среды 7,4 (при этом рН среды благодаря присутствующему в ней феноловому красному окрашена в томатный цвет). При подщелачивании среды её цвет меняется на красный  и далее на пурпурно-коричневый, а при подкислении среда становится жёлтой. Буфер HEPES нетоксичен для клеток и может быть использован вместо бикарбоната; в этом случае отпадает необходимость поддерживать 5%-ную концентрацию СО2 в воздухе. Этот буфер используется в концентрации 10-25 мМ. Антибиотики пенициллин и стрептомицинсульфат, соответственно, при концентрации 100 ед./мл и 100 мкг/мл эффективно подавляют рост грамположительных и грамотрицательных бактерий.

Подавляющее большинство клеток способно к пролиферации только в среде с различными природными добавками, обычно с сывороткой. В продаже имеются различные сыворотки крупного рогатого скота. Эти сыворотки получают либо из эмбрионов, либо от новорождённых телят.

Питательные среды, используемые в настоящее время, помимо аминокислот, витаминов, солей и глюкозы, включают в себя, как правило, сыворотку до 10%, а в ряде случаев и другие добавки. Чаще всего в лабораторных условиях используют среду 199, RPMI-1640 и минимальную среду Игла.

Растущие в культуре клетки постоянно выделяют в среду питательные вещества, потребляя из среды необходимые для роста компоненты. Такая среда называется кондиционированной.

Приёмы введения радиоактивной метки  в клетку.