Занятие 1. Определение цитотоксической и противоопухолевой активности биологически активных веществ (БАВ) (стр. 5 )

В стерильные планшеты вносят:

а) 1 ? 104 опухолевых клеток (мишени) и 2 ? 105 активированных макрофагов (эффекторы).

б) 1 ? 104 опухолевых клеток.

в) 2 ? 105 активированных макрофагов.

Контролем служат пробы, содержащие:

а) 1 ? 104 опухолевых клеток и 2 ? 105 интактных макрофагов.

б) 2 ? 105 интактных макрофагов.

Каждую опытную и контрольную группы ставят не менее, чем в 4-х параллелях. Объём смеси в каждой лунке должен составлять 200 мкл. Пробы инкубируют в полной культуральной среде при 37°С в течение 18-20 часов в атмосфере влажного воздуха с СО2. За 4 часа до окончания инкубации в пробирки вносят по 1 104 Бк меченого тимидина. По окончании инкубации их помещают на лёд для прерывания включения метки. Надосадочные жидкости осторожно отсасывают микропипеткой. К каждой пробе 0,2 мл 0,3 N NaОН и нагревают при 70°С в течение 1,5 часов. После охлаждения наносят по 50 мкл жидкости из каждой пробирки на пронумерованные карандашом кружки фильтровальной бумаги, дают им подсохнуть, после чего последовательно проводят бумажные диски через охлаждённый 5%-ный раствор ТХУ, взятый из расчёта 5 мл на диск (3 раза), оставляя их в контакте с раствором кислоты в 1-й раз не менее, чем 15 минут. Затем промывают диски 2 раза этиловым спртом и тщательно высушивают, помещают в сцинтилляционные флаконы, добавляют 5 мл толуольного сцинтиллятора и подсчитывают радиоактивность на ?-счётчике.

Процент ингибирования пролиферации опухолевых клеток определяют по формуле:

No + Nм - Nсм

No

No - имп./мин - скорость счёта опухолевых клеток,

Nм - имп./мин - скорость счёта макрофагов,

Ncм - имп./мин - скорость счёта смеси опухолевых клеток с макрофагами.

Процент активации макрофагов вычисляют как разность процентов ингибирования роста опухолевых клеток активированными и интактными макрофагами.

Приготовление лимфоцитов селезёнки (спленоцитов) для изучение реакции бласттрансформации лимфоцитов in vitro.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов - превращение лимфоцитов в культуре in vitro под влиянием различных стимуляторов в большие, способные к делению бластоподобные клетки с разрыхлённым ядром, ядрышками в ядре и базофильной цитоплазмой. Морфологически эти лимфоциты (в световом микроскопе) напоминают бластные клетки, которые появляются в лимфоидных органах после антигенной стимуляции. Во время этой реакции происходят изменения биофизических, биохимических, антигенных и функциональных характеристик клеток. Данная реакция показывает, что малый лимфоцит не является конечным продуктом клеточной дифференцировки

Реакция бласттрансформации лимфоцитов имеет исключительно важное значение для изучения основных законов клеточного активирования. Эта реакция происходит под влиянием антигенов и митогенов, и может служить хорошей моделью для изучения действия различных БАВ на процессы размножения и дифференцировки лимфоцитов.

Для получения бластогенного эффекта к суспензии лимфоцитов добавляют стимулятор. Митогены растительного (фитогемагглютинин, конканавалин А, митоген лаконоса и др.), бактериального (липополисахариды и др.) или животного (лектины и др.) происхождения являются неспецифическими стимуляторами. Неспецифическими стимулирующими свойствами обладают физические агенты (например. радиация) и некоторые БАВ.

Митогены являются поликлональными стимуляторами, вызывающими активацию интактных лимфоцитов разных специфичностей. Они вызывают быструю и интенсивную пролиферацию клеток лимфоцитов через 3-4 суток после начала культивирования. При этом количество бластных клеток составляет 50-95% от общего числа лимфоцитов (в зависимости от происхождения лимфоцитов, вида стимулятора, его дозы и условий инкубирования). Различные митогены могут стимулировать разные популяции лимфоцитов. Например, конканавалин А (Кон А) и фитогемагглютинин (ФГА) стимулируют преимущественно Т-лимфоциты, а липополисахариды бактериального происхождения (ЛПС) - В-лимфоциты. Важными свойствами стимулированных митогеном лимфоцитов являются отсутствие вторичного ответа при повторной стимуляции и специфичности в действии стимулированных лимфоцитов.

При специфическом виде активации стимуляторами могут служить самые разнообразные антигены. Они вызывают моноклональную активацию лимфоцитов. Бластогенный эффект (в популяции интактных лимфоцитов) при применении специфических стимуляторов менее выражен (менее 10% бластов) и ответ отсрочен во времени (максимальное число бластов регистрируется на 6-8 сутки стимуляции). Бласттрансформация лимфоцитов in vitro под влиянеим антигена повторяет характерные черты иммунного ответа на антиген. После распознавания антигена и пролиферации лимфоцитов образуются клетки эффекторы и клетки памяти, за счёт которых возможен вторичный ответ лимфоцитов на антиген. Вторичный ответ на антиген развивается быстрее (в течение 4-5 дней) и интенсивнее (до 20-30% бластов), чем при первичном контакте с ним.

Проведение исследования.

Мышей подвергают эвтаназии путём цервикальной дислокации, стерилизуют протиранием 70% этиловым спиртом, вскрывают и стерильно извлекают селезёнки. Селезёнки, очищенные от жира и соединительной ткани, помещают в стеклянный гомогенезатор, добавив по 2 мл культуральной среды на каждую. Клетки выдавливают в среду лёгким нажатием пестика. Полученную взвесь переносят в градуированную пробирку и объём среды доводят до 10 мл. Суспензию клеток оставляют на ледяной бане на 30 мин для осаждения клеточных агрегатов. Затем через длинную иглу шприцом отсасывают верхнюю половину взвеси, содержащую только одиночные клетки, и переносят в центрифужные пробирки, разбавляют 5 объёмами холодной (+4°С) среды 199 и центрифугируют при 1000 g в течение 10 мин. Концентрацию промытых клеток определяют, пользуясь камерой Горяева, предварительно разбавив измеренное количество суспензии клеток 3% раствором уксусной кислоты, подкрашенной до темно-голубого цвета метиленовым синим.

Для определения жизнеспособности смешивают равные объёмы клеточной суспензии и 0,2% раствор трипанового синего в физиологическом растворе. В соответствии с результатами подсчёта клеток и схемой опыта помещают необходимое количество клеток (обычно 1 ? 106 кл./мл) в лунки 96-луночных панелей, содержащие 90-180 мкл «полной» среды для культивирования, и вносят в них 10 мкл раствора митогена (ФГА, конканавалин А) и / или исследуемого вещества.

Подготовленные образцы помещают в СО2-инкубатор или эксикатор, в котором с помощью мокрой фильтровальной бумаги поддерживают влажность. Эксикатор гермитично закрывают и помещают в термостат при 37°С, где культуры содержатся в течение времени испытания, обычно 48, 72 или 96 час. За 4 час до окончания культивирования в каждую пробирку вносят по 0,74 - 1,5 ? 104 Бк  (0,2 - 0,4 мккюри) [3H]-тимидина 10-20 мкл водного раствора, встряхивают панели и снова помещают в термостат. По окончании опыта панели ставят в ледяную баню.

Для подсчёта радиоактивности клетки обрабатывают как описано в занятии 1. Аликвоту из каждой лунки переносят на мембранный фильтр, высушивают и последовательно обрабатывают 5% раствором ТХУ (3 раза) и этанолом. Высушенные фильтры помещают в счётные флаконы с толуольным сцинтиллятором и определяют радиоактивность на сцинтилляционном счётчике.

Результаты определений записывают в виде индекса стимуляции (ИС):

имп./мин в культурах со стимулятором

имп./мин в культурах без стимулятором

После инкубации необходимо обязательно контролировать жизнеспособность клеток. Число живых и мёртвых лимфоцитов определяется путём окрашивания трипановым синим и подсчёта в камере Горяева. В трёхдневных культурах жизнеспособность должна составлять не менее 65-80%.

Возможна и морфологическая оценка результатов реакции бласттрансформации. На мазках подсчитывают число трансформированных (бласты и активированные лимфоциты) и нестимулированных (малых) лимфоцитов (обычно на 500-1000 клеток в 1 мазке и выводится процент «трансформированных» клеток и индекс стимуляции по формуле

% трансформированных клеток в опыте

  % трансформированных клеток в контроле

Контролем служат лимфоциты, культивируемые в то же время без стимулятора.

       Активировать лимфоциты к бласттрансформации можно и in vivo. Для этого мышам внутрибрюшинно вводят испытуемое вещество. Через определённые промежутки времени после инъекции извлекают селезёнки, и активность лимфоцитов оценивают по уровню включения радиоактивной метки in vitro.

Литература

Мари, Р. Биохимия человека. В 2-х томах. / Р. Мари, Д. Грендер, П. Мейес, В. Родуэлл. - М.: Мир, 2004. Кнорре, химия: Учебное пособие / , , ; Новосиб. гос. ун-т, Новосибирск, 2011. 480 с. Клиническая биохимия / Ред. чл.-корр. РАН . - Изд. Дом. «ГЭОТАР-МЕД”, 2004. -512c. Иммунология: в 3-х т. Пер. с англ. /Под ред. У. Пола. - М.: Мир, 2011. -988с. Иммунологические методы. Пер. с нем. /Под ред. Х. Фримеля. - М.: Медицина, 2007. 472с. Лимфоциты: Методы: Пер. с англ. Под ред. Дж. Клауса. - М.: Мир, 2009.