Восстановление экспрессии дистрофина в клетках mdx мышей при помощи химеропласт - опосредованного пропуска экзона (стр. 4 )

У mdx мышей и у людей с МДД, есть непосредственный вид мышечных волокон, которые выражают иммунореактивность  дистрофина(то есть по крайней мере части дистрофина)  (32). Числа этих так называемых ‘ревертантных’ волокон увеличиваются с возрастом, и они хорошо установлены, что у форм белка есть внутренние делеции в пределах от нескольких экзонов до многих экзонов (33). Механизм, которым это обусловлено, неясен, но соматические мутации были предложены (34). Недавние исследования показали, что в ревертантных волокнах в пределах единственной группы  экспрессируется  та же самая форма дистрофина, предположенно, что они получены из клонального распространения единственной клетки предшественника мышцы, потомство которой - мышечные волокна локально и присуждает тем волокнам способность экспрессировать белковые формы дистрофина (33). Хотя иммуногистохимический анализ указывает, какие экзоны не экспрессируются, эти исследования не исключают возможность, что экспрессируются  многократные транскрипты.  (33 )Наши результаты предполагают, что ревертантные волокна могли явиться результатом непосредственных, соматических мутаций в последовательностях сайтов сплайсинга. Такие мутации могли составлять переменную структуру транскриптов и белков, которые экспрессируются,  и появление сокращенных форм дистрофина, в котором многократные, смежные экзоны не выражены (33).

Системная поставка олигонуклеотидов остается главным препятствием для клинического применения  антисмысловых олигонуклеатидов или химеропласта, чтобы изменить ген (13) Однако, химеропласт-опосредованное преобразование может привести к  производству функциональных форм дистрофина, ободрительно для терапевтического подхода к лечению МДД. Однако, наши результаты исследования демонстрируют, что  намного больше работы необходимо, чтобы понять механизмы, которые регулируют генное соединение дистрофина, чтобы быть в состоянии предсказать эффект изменения сайта сплайсинга такого большого и сложного гена как дистрофин. Понимание механизмов, приводящих к многократному производству транскриптов, может пролить свет на нормальный процесс формирования ревертантных волокон, процесс, у которого может также быть терапевтическое применение (35). Ясно, у модификации соединения премРНК есть большой потенциал как терапевтический подход к лечению МДД, и многократные технологии продвигают этот новый терапевтический подход.

Материалы и методы

Мыши

Мыши  mdx (C57BL/10ScSn-mdx) и контроля  C57 (C57BL/10SnJ) были получены из лаборатории Джексона и были обработаны в соответствии с руководящими принципами Административной Группы по Лабораторному Уходу за животными Стэнфордского университета.

Синтез химеропласта

Химерные  РНК/ДНК олигонуклеатиды синтезировалась как ранее описано (23) и были обеспечены Valigen Inc. (Newtown, Пенсильвания, США). Олигонуклеатиды были подготовлены с ДНК и 2 ′-O-метил РНК фосфорамидат мономерами нуклеозидов на  Expedite Nucleic Aid Synthesizer (Биосистемы PerSeptive, Фрэмингэм, Массачусетс, США), очищены HPLC, и определены количественно  спектральным анализом. Больше чем 95 % очищенных олигонуклеатидов были определены во всю длинну. Нацеленный химеропласт, определяемый  как MDX3 (Рис. 1A), был разработан, чтобы вызвать преобразование G-T в акцепторном сайте сплайсинга экзона 23 из  гена дистрофина, таким образом разрушая его последовательность  (Рис. 1B). Контрольный химеропласт, определяемый  как MDX4 (Рис. 1A), отличается от MDX3 единственным основанием  и не имеет никаких несоответствий  интрон 22/экзон 23 сайта сплайсинга. Таким образом у MDX4 должны быть все гомологичные свойства  MDX3, но ни одно из его  оснований не заменяет другое  в mdx клетках.

Культура клеток и трансфекция

Клетки были получены из мышцы конечности новорожденных mdx и мышей C57 как ранее описано. Для роста клетки  расположили на пластинах, покрытых 5 мкг/мл ламилина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США), и поддержали в питательной среде, состоящей из питательной смеси  F10 (Mediatech, Херндон, Вирджиния, США) подкрепленный с20%-ой эмбриональной бычьей сывороткой (Научная Омега, Тарзана, Калифорния, США) и пенициллином/стрептомицином (Mediatech). Клеточная дифференцировка была вызвана, поддерживая клетки в низкой серологической питательной среде (‘питательная среда дифференцирования’) состоящий из питательной среды модифицированной Далбекко (Mediatech), подкрепленный с 2%-ой сывороткой лошади (Invitrogen) и пенициллином/стрептомицином.

Миобласты были  на  шести  пластинах (1Ч105 клетки/хорошо) 12  часов  до трансфекции. химеропласта (10 µg) были обработаны  1 мкл Lipofectamine 2000 (GIBCO/BRL) в течение 30 минут при комнатной температуре в суммарном объеме 0.5 мл F10 . Комплекс был тогда добавлен к  1.5 мл питательной среды  16  часов. Трансфекция была остановлена, заменяя раствор для трансфекции  новой питательной средой.

Вестерн-блот-анализ

Клетки были растворенны в буфере RIPA (50-миллиметровые Тримараны-HCl, pH фактор 7.4, 150-мМ NaCl, 0.5 % deoxycholate, и 1 % Nonidet P-40) содержащий апротинина (20 мкг/мл), леупептин (20 мкг/мл), phenylmethylsulfonyl фтористый фенилметилсульфонил  (10 мкг/мл), и ортованадат натрия (1 мМ), и полный белок в экстракте был определен пробой белка Биорадиуса (Биорадиус, Геркулес, Калифорния, США). Для  обнаружения дистрофина 350 мкг полного белка от каждого образца были отделены электрофорезом (10 миллиампер 15 часов) использование 5%-ых гелей СИСТЕМЫ-ПКО-POLYACRYLAMIDE, и затем перешли (250 миллиампер 7 часов) на нитроклетчаточные мембраны. Мембраны были исследованы быстро  4°C с антителами, направленными к области фибрил (Mandys-8, 1:400; Сигма) или  C-терминальной области (Dys-2, 1:50; Novacastra, Ньюкасл, Великобритания)  дистрофина как ранее описано. Мембраны были заблокированы  5%-ым молоком в PBS  1 час при комнатной температуре. Пятна были вымыты 0.05 % PBS и затем реагировали с  пероксидазой антимышинными вторичными антителами (Эмершем Фармэсия Байотеч, Пискэтэуэй, Нью-Джерси, США). Определенное связывающее антитело было обнаружено, используя расширенную хемилюминесцентную систему (Эмершем).

Проба ARMS и анализ рестрикционной эндонуклеазы

Культивируемые миобласты были ополоснуты дважды в PBS, и геномная ДНК была извлечена, используя Геномный комплект извлечения ДНК (Промега, Мадисон, Висконсин, США) согласно инструкциям изготовителя. Для каждой реакции амплификации 500 нанограммов полной ДНК, извлеченной из культур миобластов, были переварены  2 часа в 37°C с Sal I или NotI, чтобы развернуть супернамотанную структуру ДНК как ранее описано.

Обозначения и последовательности всех инициаторов PCR перечислены в Таблице 2. Для ARMS ( невосприимчивая амплификационная система мутации) пробы мы использовали передовой инициатор в интроне 22 [F (интервал) 22] и любой из двух обратных инициаторов. Один, определяемый ‘w’, было определенным для интрона дикого типа 22/экзон 23 последовательности сайтов сплайсинга и другой, определял ‘m3’, было определенным для последовательности сайтов сплайсинга после трансверсии G-T в нуклеотиде 3137 (см. Рис. 1B). Параметры настройки ПЦР и условия реакции были  ранее описаны. Продукты ДНК фракционировались на 2%-ых гелях агарозы в Tris-acetate/EDTA буфере. Продукты ПЦР были очищены, используя Qiaquick (Qiagen Inc., Валенсия, Калифорния, США), и отщепление ДНК было выполнено, используя Прикладные Биосистемы, ABI377 автоматизировал секвенсер.

Праймер	Последовательность	Гомологичный регион
F(int)22	AACTCATCAAATATGCGTGTTAGTG	intron 22	1, 2
w	GCTCTTTCAAAGAACTTTGCAGACC	exon 23	1
m 3	GCTCTTTCAAAGAACTTTGCAGACA	exon 23	1
R23	CTGGCATATTTCTGAAGGTGC	exon 23	2, 4
R32	GGCTGGTTTTTGGAATAATCG	exon 32	3, 4
F22	GACACTTTACCACCAATGCG	exon 22	3
F22in	GGAGACAATGAGTAGCATCAGG	exon 22	4
R24	CAGGGCAGGCCATTCCTCTTTC	exon 24	4
R25	CTGCCCACCTTCATTAACAC	exon 25	4
R30	GGACCTTTTCAATTTCCTGGGC	exon 30	4
R33	CTGCTTTTTCTGTACAATTTGACG	exon 33	3
R35out	CTGGAGGTGACAGCTATCCAG	exon 35	3
R43out	CTTTCACCTTTTCCATGGAGG	exon 43	3
R50out	CCAGTAGTGCTCAGTCCAGGG	exon 50	3
F8	GTGGAAATGTTGCCCAGGAC	exon 8	3
F9	GTTATGCCTTCACACAGGCTGC	exon 9	4
F19	GCAAGATGCCAGCAGATCAGC	exon 19	4
R35in	CTTGCCCAACACCATTTTCAAAG	exon 35	4
R43in	CAATCCGACCTGAGATTTGTTGC	exon 43	4
R50in	GGTTTACAGCCTCCCACTCAG	exon 50	4

In this window

In a new window

Таблица  2.

ПЦР праймеры

Анализ эндонуклеазы  был выполнен на полной геномной ДНК. 200 нанограммов геномной ДНК были подвергнуты ПЦР амплификации, используя передовой инициатор в интроне 22 [F (интервал) 22] и обратный инициатор в экзоне 23 (R23). Каждая смесь амплификации  содержала 25 пмоль адекватного инициатора, 10%-ого диметилсульфоксида, 0.5 полимеразы ДНК Владельца U Тэка (Takara, Panvera Corp., Мадисон, Висконсин, США), и 5 мМ каждого трифосфата дезоксирибонуклеотида. После начального шага денатурации  95°C в течение 5 минут, амплификация была выполнена в 35 циклов при 95°C в течение 1 минуты, сопровождаемой 55°C в течение 3 минут, и вытяжение в 72°C для 2 минимальных реакций Амплификация  была закончена дополнительным этапом при  72°C в течение 10 минут. Продукты ПЦР были загружены на 2%-ом геле агарозы, и ожидаемые 150 bp продуктов амплификации были  очищены с использованием комплекта извлечения геля Qiagen. Из 30 мкл повторно приостановленного продукта ДНК 5 мкл были подвергнуты второму раунду ПЦР с  использованием тех же самых условий, ранее описанных с добавлением 10 mCi [32P] dCTP. Радиоактивные образцы были очищены, используя Amicon Microcon®-PCR (Millipore Corporation, Бедфорд, Массачусетс, США) и повторно приостановлены в 50 мкл H20. Десять микролитров были переварены  в течение часа  при  37°C с Hinf I рестриктаз  и нанесены  на 8 %, неденатурирующий гель акриламида.