Вложенный RT–PCR
Полная РНК была извлечена из культивируемых мышечных волокон, используя РЕАКТИВ ТРИМАРАНА (Сигма). Для каждой реакции 100 нанограммов РНК обработанны с 1 U дезоксирибонуклеазы I (GIBCO/BRL) при комнатной температуре и подвергнуты ретротранскрибцииRT–PCR (Qiagen). Обратная транскрипция и первый этап амплификации были выполнены, используя обратный инициатор в экзоне 33 (R33), соединенный с передовым инициатором в экзоне 22 (F22). Вложенный ПЦР был выполнен на 2 мкл первой реакции амплификации, используя передовой (внутренний) инициатор в экзоне 22 (F22in) и обратные инициаторы в экзонах 23 (R23), 24 (R24), 25 (R25), 30 (R30) и 32 (R32).
Чтобы обнаружить альтернативные продукты вне области между экзонами 22 и 32 (см. Рис. 6), ряд различной обратной транскрипции и первые этапы реакции амплификации были выполнены, используя обратные инициаторы в экзонах 33 (R33), 35 (R35out), 43 (R43out) и 50 (R50out), соединенный с передовым инициатором в экзоне 8 (F8). Вложенный ПЦР была выполнена с передовыми инициаторами в экзонах 9 (F9) и 19 (F19), соединенный с обратными инициаторами в экзонах 32 (R32), 35 (R35in), 43 (R43in) и 50 (R50in). Амплификация была выполнена в 25 циклов при 94°C 30 сек, 55°C в течение 2 минут и 72°C в течение 2 минут. Продукты ПЦР были удалены из геля агарозы, очищены с использованием комплекта извлечения геля Qiagen, и упорядочены с использованием автоматизированного секвенсера.
Анализ последовательности сайта сплайсинга
Последовательности гена дистрофина мышей были восстановлены из базы данных генома мыши NCBI. Геномная ДНК была изолирована как ранее описано от неинфицированных вирусом клеток или клеток, инфицированных вирусом с MDX3, которые сохранялись в культуре в течение 3 месяцев после трансфекции. Исследования последовательностей сайтов сплайсинга были выполнены, используя 100 нанограммов геномной ДНК. Интрон 22/экзон 23 сайт сплайсинга был амплифицирован, используя F (интервал) 22 и инициаторы R23, ранее описанные. Для всех других сайтов сплайсинга полностью изменены инициаторы, и разработаны, чтобы усилить ∼400 bp, включая целый экзон и донорские и акцепторные сайты сплайсинга. Амплификация была выполнена в 30 циклов, используя параметры настройки, ранее описанные для анализа эндонуклеазы. Продукты ПЦР были на гелях агарозы, их очистили и повторно приостановили в 30 мкл H2O. Второй раунд амплификации был выполнен, используя 2 мкл очищенного продукта еще 30 циклов. Второй раунд ПЦР был очищен и упорядочен как ранее описано. Последовательности инициатора и электроферограммы предоставляются по запросу.
Иммуногистохимия
Иммунное окрашивание было выполнено как ранее описано (20,36). Кратко, клетки, культивируемые на покровных стеклах, были фиксированы в ледяном этаноле в течение 10 минут, ополоснутых в PBS, и связанные с усилением проницаемости в Тритоне на 0.3 % X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Раствор, содержащий 5 %, инактивированной высокой температурой нормальной сыворотки козы и BSA на 1 мг/мл в PBS использовались в качестве блокирования раствора 30 минут.. Клетки инкубированы с основными антителами к дистрофину (Mandys-18, 1:100, щедрый подарок доктора Гленна Морриса, Северо-восточного Института Уэльса, Рексхэм, Великобритания; Mandys-8, 1:200, Novacastra; Dys-2, 1:25, Novacastra) или б-дистрогликана (VIA4-1, 1:100; Биотехнология Провинциальных областей штата, Лейк-Плэсид, Нью-Йорк, США) быстро при 4°C. Клетки были вымыты в PBS перед инкубацией в течение 1 часа при комнатной температуре с AlexaTM 546- анти-мышиными антителами козы (H+L) (1:250; Молекулярные Исследования, Юджин, Орегон, США) или FITC-антимышинными антителами (целая молекула; 1:200; Cappel ICN Pharmaceuticals Inc. Аврора, Огайо, США). Покровные стекла были установлены, используя Щит Vecta (Vector Inc., Берлингейм, Калифорния, США) для флюоресцентной микроскопии.
Примечания
- ↵* Все письма адресуйте в Департамент неврологии и неврологическому научному обществу Станфордского университета Medical Center, Room A-343, Stanford, CA 94305-5235, USA. Tel: +1 6508583976; Fax: +1 6508583935; Email: *****@***edu
Ссылки
↵Koenig, M., Hoffman, E. P., Bertelson, C. J., Monaco, A. P., Feener, C. and Kunkel, L. M. (1987) Complete cloning of the Duchenne muscular dystrophy (DMD) cDNA and preliminary genomic organization of the DMD gene in normal and affected individuals. Cell, 50, 509–517.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Amalfitano, A., Rafael, J. A. and Chamberlain, J. S. (1996) Structure and mutation of the dystrophin gene. In Brown, S. C. and Lucy, J. A. (eds), Dystrophin., Cambridge University Press, Cambridge, pp. 1–26.
↵Monaco, A. P., Bertelson, C. J., Liechti-Gallati, S., Moser, H. and Kunkel, L. M. (1988) An explanation for the phenotypic differences between patients bearing partial deletions of the DMD locus. Genomics, 2, 90–95.
CrossRefMedline
↵Chen, H. H., Mack, L. M., Choi, S. Y., Ontell, M., Kochanek, S. and Clemens, P. R. (1999) DNA from both high-capacity and first-generation adenoviral vectors remains intact in skeletal muscle. Hum. Gene Ther., 10, 365–373.
CrossRefMedlineWeb of Science
Gilbert, R., Nalbantoglu, J., Howell, J. M., Davies, L., Fletcher, S., Amalfitano, A., Petrof, B. J., Kamen, A., Massie, B. and Karpati, G. (2001) Dystrophin expression in muscle following gene transfer with a fully deleted (‘gutted’) adenovirus is markedly improved by trans-acting adenoviral gene products. Hum. Gene Ther., 12, 1741–1755.
CrossRefMedlineWeb of Science
Wang, B., Li, J. and Xiao, X. (2000) Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 13714–13719.Abstract/FREE Full Text
↵Hauser, M. A., Amalfitano, A., Kumar-Singh, R., Hauschka, S. D. and Chamberlain, J. S. (1997) Improved adenoviral vectors for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Neuromusc. Disord., 7, 277–283.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵De Angelis, F. G., Sthandier, O., Berarducci, B., Toso, S., Galluzzi, G., Ricci, E., Cossu, G. and Bozzoni, I. (2002) Chimeric snRNA molecules carrying antisense sequences against the splice junctions of exon 51 of the dystrophin pre-mRNA induce exon skipping and restoration of a dystrophin synthesis in Delta 48-50 DMD cells. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 9456–9461.
Abstract/FREE Full Text
↵Dunckley, M. G., Manoharan, M., Villiet, P., Eperon, I. C. and Dickson, G. (1998) Modification of splicing in the dystrophin gene in cultured mdx muscle cells by antisense oligoribonucleotides. Hum. Mol. Genet., 7, 1083–1090.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Mann, C. J., Honeyman, K., Cheng, A. J., Ly, T., Lloyd, F., Fletcher, S., Morgan, J. E., Partridge, T. A. and Wilton, S. D. (2001) Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 42–47.
Abstract/FREE Full Text
van Deutekom, J. C., Bremmer-Bout, M., Janson, A. A., Ginjaar, I. B., Baas, F., den Dunnen, J. T. and van Ommen, G. J. (2001) Antisense-induced exon skipping restores dystrophin expression in DMD patient derived muscle cells. Hum. Mol. Genet., 10, 1547–1554.Abstract/FREE Full Text
↵Wilton, S. D., Lloyd, F., Carville, K., Fletcher, S., Honeyman, K., Agrawal, S. and Kole, R. (1999) Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides. Neuromusc. Disord., 9, 330–338.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵
Rando, T. A. (2002) Oligonucleotide-mediated gene therapy for muscular dystrophies. Neuromusc. Disord., 12, S55–S60.
↵Kapsa, R. M., Quigley, A. F., Vadolas, J., Steeper, K., Ioannou, P. A., Byrne, E. and Kornberg, A. J. (2002) Targeted gene correction in the mdx mouse using short DNA fragments: towards application with bone marrow-derived cells for autologous remodeling of dystrophic muscle. Gene Ther., 9, 695–699.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Rice, M. C., Czymmek, K. and Kmiec, E. B. (2001) The potential of nucleic acid repair in functional genomics. Nat. Biotechnol., 19, 321–326.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Gamper, H. B. Jr, Cole-Strauss, A., Metz, R., Parekh, H., Kumar, R. and Kmiec, E. B. (2000) A plausible mechanism for gene correction by chimeric oligonucleotides. Biochemistry, 39, 5808–5816.
CrossRefMedline
↵Kren, B. T., Metz, R., Kumar, R. and Steer, C. J. (1999) Gene repair using chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Semin. Liver Dis., 19, 93–104.
MedlineWeb of Science
↵Kren, B. T., Parashar, B., Bandyopadhyay, P., Chowdhury, N. R., Chowdhury, J. R. and Steer, C. J. (1999) Correction of the UDP-glucuronosyltransferase gene defect in the Gunn rat model of Crigler–Najjar syndrome type I with a chimeric oligonucleotide. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96, 10349–10354.
Abstract/FREE Full Text
↵Kren, B. T., Bandyopadhyay, P. and Steer, C. J. (1998) In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides. Nat. Med., 4, 285–290.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Bertoni, C. and Rando, T. A. (2002) Dystrophin gene repair in mdx muscle precursor cells in vitro and in vivo mediated by RNA–DNA chimeric oligonucleotides. Hum. Gene Ther., 13, 707–718.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Rando, T. A., Disatnik, M. H. and Zhou, L. Z. (2000) Rescue of dystrophin expression in mdx mouse muscle by RNA/DNA oligonucleotides. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 5363–5368.
Abstract/FREE Full Text
Tagalakis, A. D., Graham, I. R., Riddell, D. R., Dickson, J. G. and Owen, J. S. (2001) Gene correction of the apolipoprotein (apo) E2 phenotype to wild-type apoE3 by in situ chimeraplasty. J. Biol. Chem., 276, 13226–13230.Abstract/FREE Full Text
↵Yoon, K., Cole-Strauss, A. and Kmiec, E. B. (1996) Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNA:DNA oligonucleotide. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 2071–2076.
Abstract/FREE Full Text
↵Cole-Strauss, A., Yoon, K., Xiang, Y., Byrne, B. C., Rice, M. C., Gryn, J., Holloman, W. K. and Kmiec, E. B. (1996) Correction of the mutation responsible for sickle cell anemia by an RNA–DNA oligonucleotide. Science, 273, 1386–1389.
Abstract
↵Alexeev, V., Igoucheva, O., Domashenko, A., Cotsarelis, G. and Yoon, K. (2000) Localized in vivo genotypic and phenotypic correction of the albino mutation in skin by RNA–DNA oligonucleotide. Nat. Biotechnol., 18, 43–47.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Igoucheva, O. A. and Yoon, K. (2002) Gene correction frequency by chimeric RNA–DNA oligonucleotide using nuclear extracts. Meth. Mol. Med., 69, 95–107.
↵Ohlendieck, K. and Campbell, K. P. (1991) Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J. Cell Biol., 115, 1685–1694.
Abstract/FREE Full Text
↵Harper, S. Q., Hauser, M. A., DelloRusso, C., Duan, D., Crawford, R. W., Phelps, S. F., Harper, H. A., Robinson, A. S., Engelhardt, J. F., Brooks, S. V. and Chamberlain, J. S. (2002) Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. Nat. Med., 8, 253–261.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Sironi, M., Pozzoli, U., Cagliani, R., Comi, G. P., Bardoni, A. and Bresolin, N. (2001) Analysis of splicing parameters in the dystrophin gene: relevance for physiological and pathogenetic splicing mechanisms. Hum. Genet., 109, 73–84.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Melis, M. A., Muntoni, F., Cau, M., Loi, D., Puddu, A., Boccone, L., Mateddu, A., Cianchetti, C. and Cao, A. (1998) Novel nonsense mutation (C→A nt 10512) in exon 72 of dystrophin gene leading to exon skipping in a patient with a mild dystrophinopathy. Hum. Mutat., 11, S137–S138.
↵Cartegni, L., Chew, S. L. and Krainer, A. R. (2002) Listening to silence and understanding nonsense: exonic mutations that affect splicing. Nat. Rev. Genet., 3, 285–298.
CrossRefMedlineWeb of Science
Thanh, L. T., Nguyen, T. M., Helliwell, T. R. and Morris, G. E. (1995) Characterization of revertant muscle fibers in Duchenne muscular dystrophy, using exon-specific monoclonal antibodies against dystrophin. Am. J. Hum. Genet., 56, 725–731.
MedlineWeb of Science
↵Lu, Q. L., Morris, G. E., Wilton, S. D., Ly, T., Artem'yeva, O. V., Strong, P. and Partridge, T. A. (2000) Massive idiosyncratic exon skipping corrects the nonsense mutation in dystrophic mouse muscle and produces functional revertant fibers by clonal expansion. J. Cell Biol., 148, 985–996.
Abstract/FREE Full Text
↵Hoffman, E. P., Morgan, J. E., Watkins, S. C. and Partridge, T. A. (1990) Somatic reversion/suppression of the mouse mdx phenotype in vivo. J. Neurol. Sci., 99, 9–25.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Wilton, S. D., Dye, D. E., Blechynden, L. M. and Laing, N. G. (1997) Revertant fibres: a possible genetic therapy for Duchenne muscular dystrophy? Neuromusc. Disord., 7, 329–335.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵Rando, T. A., Disatnik, M. H., Yu, Y. and Franco, A. (1998) Muscle cells from mdx mice have an increased susceptibility to oxidative stress. Neuromusc. Disord., 8, 14–21.
CrossRefMedlineWeb of Science
↵
Newton, C. R., Graham, A., Heptinstall, L. E., Powell, S. J., Summers, C., Kalsheker, N., Smith, J. C. and Markham, A. F. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucl. Acids Res., 17, 2503–2516.
Оригинальная статья http://hmg. oxfordjournals. org/content/12/10/1087.full? view=long&pmid=12719373
Переведено проектом МОЙМИО http://www. mymio. org
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 |
