4.Затем тушку переносят в стерильный стакан (флакон) и ножницами мелко ее измельчают.
5.Тканевую суспензию переносят в колбу с теплым 0,25% раствором трипсина, опускают в нее стерильный магнит, запаянный в стеклянную и полихлорвиниловую и ставят на электромагнитную мешалку на 15-20 минут. За это время трипсин, как протеолитический фермент, растворяет оболочку клетки от тканевых кусочков.
6.Затем раствор трипсина с клетками фильтруют через 2-3-й слой марли в стерильный флакон.
7.Полученную клеточную взвесь разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 10-15 минут со скоростью не более 400-500 оборотов в минуту, чтобы механическим давлением не разрушить клетки.
К тканевому осадку снова добавляют теплый раствор трипсина, ставят на электромагнитную мешалку и процесс повторяется до тех пор полка все тканевые кусочки не превратятся в клетки.
8.После центрифугирования на дне оседает светло-розовый слой клеток. Раствор трипсина сливают, к осадку добавляют питательную среду, осадок острожно встряхивают и переносят в колбу с ростовой питательной средой. Клеточную взвесь дополнительно пипетируют (ресуспензируют) стерильной пипеткой.
9.Определяют исходную концентрацию клеток в камере Горяева по формуле подсчета лейкоцитов. Доводят до нужной концентрации 600-800 тысяч клеток в 1мл.
10.Подготовленную клеточную взвесь разливают по 1мл в стерильные пробирки, плотно закрывают пробками и ставят маркером по стеклу продольную черту на пробирке и укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6° чертой вверх. Черта является ориентиром, что на противоположной стороне пробирки формируется клеточный монослой. Штатив с пробирками помещают в термостат при температуре 37°С на 2-3 суток.
11.Ежедневно в специальном горизонтальном штативе проводят микроскопию КК при малом увеличении. Для этого пробирку фиксируют чертой вниз и определяют время формирования густого монослоя клеток. По аналогичной методике готовят первичные или трипсинизированные КК из органов лабораторных, сельскохозяйственных животных или из органов молодых убитых животных. Для приготовления культуры клеток применяется специальная методика подготовки посуды.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:
Студенты знакомятся с классификацией культур клеток. Студенты знакомятся с питательными средами для культур клеток. Студенты знакомятся с правилами приготовления однослойной трипсинизированной культурой клеток в боксе кафедры. Студенты микроскопируют монослой однослойной трипсинизированной культуры клеток.КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1.Какова классификация культур клеток?
2.Каковы поддерживающие и ростовые питательные среды для культур клеток?
3.Какова схема приготовления однослойной трипсинизированной культуры клеток?
ЗАНЯТИЕ 9
Методы заражения культур клеток. Цитопатогенное действие вируса на клетку.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомить студентов с методикой заражения однослойной первично-трипсинизированной культурой клеток и оценкой результата действия вирусов на клетку по цитопатогенному действию.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:
- Питательные среды и сбалансированные солевые растворы для культур клеток (раствор Хенкса, раствор Версена);
- нормальные консервированные культуры клеток и культура клеток с ЦПД;
- вирусосодержащий материал;
- свежеприготовленные культуры клеток;
- спиртовки;
- подготовленный стерильный бокс;
- стерильные пробирки, пипетки;
- микроскопы;
- штативы для микроскопии пробирок с культурами клеток;
- ватные спиртовые тампоны для обработки рук;
- квачик для обжигания пробок питательной среды и р-ра Хенкса.
Культивирование вирусов в культуре клеток сводится к следующему: подбору культуры клеток; получению вируссодержащего материала; подготовке для заражения; заражению клеток вируссодержащим материалом; культивированию вируса в клетках; индикации вируса в культуре клеток; сбору культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.
Подбор культур клеток.
Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима.
Клетки, засеянные в питательную среду, оседают вниз, прикрепляются к стеклу и начинают активно размножаться в термостате при температуре 37°С. Через 2-3 суток после их засева формируется сплошной клеточный слой (монослой), который определяется путем микроскопии культуры клеток при малом увеличении в специальных металлических или деревянных штативах.
Скорость формирования клеточного монослоя зависит от вида ткани, вида животных, качества ростовой питательной среды, исходной концентрации клеток при засеве и других факторов. Для культивирования вируса используют чувствительные молодые культуры клеток. Продлить жизнедеятельность клеток монослоя можно заменой ростовой питательной среды поддерживающей средой и помещением культуры клеток в бытовой холодильник при температуре +2° +4°С.
Техника заражения культур клеток.
Перед заражением путем микроскопии отбирают пробирки культур клеток (КК) с хорошим сплошным монослоем. Дальнейшая работа с культурами клеток проводится в стерильном боксе. Заражение КК проводят 10% рабочей суспензией, приготовленной из исследуемого материала (патматериала) или вируссодержащим материалом, свободным от бактериальной и грибковой микрофлоры.
Применяют 2 способа заражения.
1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии.
4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду.
Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при температуре +37°С.
2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6° и ставят в термостат на инкубацию.
Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД. Микроскопию всегда начинают с контрольных КК.
Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.
Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопатическому (цитопатогенному) действию.
Американский ученый Хуанг в 1945 году объединил все дегенеративные изменения в пораженной вирусом клетке под общим названием ЦПД или ЦПЭ (цитоплазменное действие вируса или цитоплазменный эффект).
ЦПД называются любые изменения клеток в культуре клеток под влиянием размножающегося в них вируса.
ЦПД - это морфологические и функциональные изменения в культуре клеток под действием вируса, т. е. дегенерация, перерождение разрушение и гибель клетки.
Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8-10, окуляр х7-10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток.
Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 - на три, если 1⁄2 - на два креста, 1⁄4- на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.
Нельзя допускать дегенерации всех клеток монослоя, т. к температура термостата (+37°С) инактвирует значительную часть освободившегося вируса в культуральной жидкость. Выраженные поражения 50% клеток монослоя свидетельствуют об активной репродукции вируса во всех клетках. Зараженные пробирки или матрацы энергично встряхивают, клетки разрушаются, вирус заходит в питательную среду, которая называется культуральная жидкость.
Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 сут. после заражения (энтеровирусы), другие - через 1-2 нед. (аденовирусы).
Ряд авторов пытались сгруппировать сходные формы ЦПД. У одних получилось 23 формы, у других - 11, У третьих -5 и т. д. Но наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование.
Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
