А. Со стороны пути. Ножницами вскрывают пугу, иглой или пинцетом отпрепаровываем второй листок подскорлуповой оболочки в месте хорошо развитых кровеносных сосудов, наносим вирусосодержащий материал и тем же листком прикрываем. Окошечко в скорлупе закрывается покровным стеклом (или мелким часовым стеклом) и заливаем парафином.
Б. На границе пуги выпиливается скорлупа - 5x5x5 мм, отпрепаровывается подскорлуповая оболочка, а затем все также как в пункте "а".
С. Окошечко делается сбоку против зародыша. В этом случае иногда надо делать противоотверстие со стороны пуги и с помощью груши отсасывать воздух.
2. Заражение в аллантоисную полость. Применяется чаще других. Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения - 0,1 мл. Можно культивировать вирус гриппа, чумы птиц, чумы собак, инфлуэнцы. Существует два способа.
А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настолько, чтобы попасть в аллантоисную полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином.
Б. Против предлежания фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 0,5 см. Отверстие закрываем парафином.
3. Заражение в амниотическую полость. Возраст эмбриона 9-11 дней. Доза заражения - 0,1 мл. Существует два способа.
А. Через пугу. Делаем отверстие для иглы. Иглу погружаем настолько, чтобы попасть в амниотическую полость. После введения вируссодержащего материала отверстие закрываем расплавленным парафином.
Б. Против предлежания фиксируем крестиком вверх, отступив от крестика 2-3 мм вверх делаем прокол иглой приблизительно на 1,5 см. Отверстие закрываем парафином.
3. В желточный мешок. В этом случае используют 5-7 дневные эмбрионы. Доза заражения 0,5-1,0 мл. Применяют при орнитозе, пситтакозе, энцефалитах, риккетсиозах, бруцеллезе. Существует два способа.
А. Яйцо фиксируется крестиком вниз, сверху в центре яйца делается прокол скорлупы и вводится игла на 1,5-2 см, чтобы попасть в желточный мешок. Отверстие закрывается парафином.
Б. Яйцо оставляют в том же положении, прокол делают со стороны пути, иглу вводим с уклоном вверх, чтобы попасть в желточный мешок на 3-4 см. Отверстие закрывается парафином.
Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации при температуре +37°С - +38°С в процессе которой происходит культивирование вирусов.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:
Студенты знакомятся с видами лабораторных животных. Студенты проводят интраназальное и внутримышечное заражение белых мышей. Студенты наблюдают за состоянием лабораторного животного после заражения. Студенты знакомятся с методами заражения куриных эмбрионов. Студенты проводят овоскопию куриных эмбрионов. Студенты заражают куриные эмбрионы.КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1.Для каких целей и какими методами заражают лабораторных животных в вирусологической практике?
2.Каковы признаки наличия вируса в организме лабораторных животных?
3.Каковы особенности культивирование вирусов в организме лабораторных животных?
4.Для каких целей заражают курные эмбрионы?
5.Каково преимущество заражения куриных эмбрионов?
6.Каковы методы заражения куриных эмбрионов?
ЗАНЯТИЕ 7
Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомить студентов с особенностями отбора
вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:
- Подготовленный для работы бокс;
- халаты, перчатки, маски, головные уборы и бахилы;
- зараженные 7-9 суточные куриные эмбрионы;
- набор стерильных хирургических инструментов - пинцет, ножницы, скальпель в стаканчике со спиртом;
- стерильные пастеровские пипетки с резиновой грушей;
- спиртовки;
- иодированный спирт для дезинфекции скорлупы;
- стерильная чашка Петри - 3 шт.;
- флакон со стерильным физраствором;
- стерильные пробирки - 10 шт.;
- штатив для пробирок;
- ватный квачик в пустой пробирке для обжигания скорлупы.
Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации при температуре +37°С - +38°С в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах.
За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая погибших. Погибшие эмбрионы не обладают подвижностью, их кровеносные сосуды загустевают или в них выражена прерывистость, нет пульсации.
Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой +4°С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой – уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие. Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 суток. Затем эмбрионы умервщляют охлаждением при +4°С в течение 3-4 часов и вскрывают.
Вскрывают куриные эмбрионы с целью обнаружения признаков размножения в них вирусов и получения вирусосодержащего материала. Последнее требует правил асептики при вскрытии.
В зависимости от того, каким вирусом был заражен эмбрион (а значит в какой структуре он накопился соответственно тропизму), вирусосодержащим материалом могут служить ХАО, ткани зародыша, желточный мешок (его стенки), а также аллантоисная и амниотическая жидкости. В последнем случае выделение вируса наиболее удобно, так как экстраэмбриональные (аллантоисная, амниотическая) жидкости представляют, по существу готовую суспензию вируса.
Перед вскрытием скорлупу обрабатывают йодированным спиртом (фламбируют). Стерильным ножницам срезают скорлупу над воздушной камерой, через которую заражали. При этом яйцо держат под некоторым углом, чтобы скорлупа не упала внутрь.
Обнажившуюся ХАО осматривают, приподнимая ее пинцетом с целью установления в ней патологоанатомических изменений. Часть ХАО, на которую был нанесен вирусосодержащий материал, имеет обычно наиболее выраженные изменения. Для более тщательного осмотра ее и взятия этой части приподнимают пинцетом ХАО, в этом месте срезают как можно больше, переносят ее в стерильную чашку Петри с физраствором, ополаскивают, расправляют пинцетами и рассматривают на темном фоне. Наиболее характерные изменения на ХАО соответствуют определенному вирусу: очень часто просматриваются округлые воспалительные очаги, белесоватые перламутровые бляшки с некротическим центром, серовато-белый цвет оспин, расширение сосудов и др.
Аллантоисную жидкость в количестве до 10 мл отсасывают пипеткой, которой прокалывают подскорлуповую оболочку ХАО над телом зародыша. Такое направление пипетки предотвращает случайный разрыв стенки желточного мешка и смешивание его содержимого с набираемой аллантоисной жидкостью.
Амниотической жидкости удается отсосать до 1 мл. Для этого после удаления аллантоисной жидкости пипетку вводят в амнион между головой и телом зародыша под его шеей.
Для получения желточного мешка как вирусосдержащего материала желток извлекают на чашку Петри, стенку его разрезают ножницами и отполаскивают от содержимого в физрастворе. Тело зародыша извлекают удерживая его за шею.
Наличие гемагглютинирующего вируса определяют в ориентировочной реакции гемагглютинации.
При вскрытии куриных эмбрионов ставят бактериологический контроль вирусосодержащего материала посевом на МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. Вирусосодержащий материал хранят при минус 25°С и ниже.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:
1.Студенты знакомятся с методами вскрытия куриных эмбрионов.
2.Студенты проводят овоскопию погибших куриных эмбрионов.
3.Студенты вскрывают куриные эмбрионы.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
1.Для каких целей вскрывают курные эмбрионы?
2.Каковы признаки наличия вируса в куриных эмбрионах?
3.Каковы методы вскрытия куриных эмбрионов?
ЗАНЯТИЕ № 8
Культивирование вирусов на культуре клеток.
ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: Ознакомить студентов с культурами клеток, их
классификацией и практическим применением, а также с питательными средами для культур клеток и с техникой приготовления одноклеточных трипсинизированных культур клеток.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ:
Подготовить на рабочем столе в боксе:
- Набор стерильных хирургических инструментов - пинцет, ножницы, скальпель в стаканчике со спиртом;
- спиртовые ватные тампоны в чашках Петри для обработки рук;
- живой куриный эмбрион или другой свежий для изготовления культуры клеток.
- спиртовки;
- раствор Хенкса или фосфатно-буферный раствор;
- 2 стерильные чашки Петри;
- стерильный флакон с пробкой для измельчения ткани;
- 0,25% раствор трипсина;
- электромагнитная мешалка;
- запаянный в полихлорвиниловой капсуле магнит;
- стерильные пипетки на 1 мл - 10 шт.;
- стерильные резиновые пробки для пробирок - 10 шт.;
- стерильные центрифужные пробирки с пробками - 10 шт.;
- центрифуга;
- питательная среда 199;
- микроскоп с осветителем;
- камера Горяева с притертым покровным стеклом для подсчета концентрации клеток в питательной среде;
- горизонтальный штатив для пробирок;
- маркер;
- халаты, перчатки, маски, головные уборы и бахилы.
Культура клеток (КК) - это изолированные, преимущественно эмбриональные, клетки различных органов животных (почек, легких, семенников, кожи, мышц и др.), живущие и размножающиеся в искусственных условиях вне организма (in vitro) в специальных питательных средах.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
