Общая вирусология Методические указания для лабораторных занятий студентов факультета ветеринарной медицины по специализации 36.05.01 - «Ветеринария» (стр. 9 )

  Культуры клеток можно получать не только из органов эмбрио­нов,  но и из органов различных молодых убитых животных,  одна­ко адаптация эмбриональных клеток к искусственным питательным средам,  интенсивность размножения и чувствительность их к различным вирусам значительно выше,  чем у клеток,  полученных из органов молодых и взрослых животных.

  Часто в ветеринарной практике для приготовления КК используют 9-10 суточные куриные эмбрионы  (КЭ),  эмбрионы кроликов,  мышей, морских свинок, различных сельскохозяйственных и домашних жи­вотных.  В медицинской вирусологии чаше всего применяют различ­ные перевиваемые линии клеток и культуры клеток из фибробластов эмбриона человека.  Этот материал очень дешевый,  стерильный и всегда в  достаточном количестве имеется в гинекологических отделениях родильных домов, после прерывания беременности у женщин.

  Открытию метода культивирования животных клеток in vitro предшествовали многолетние поиски и разработки рецепта питательной среды для изготовления дешевой лабораторной модели для культивирования вирусов, которые могли бы заменить КЭ, лабораторных и сельскохозяйственных животных. Приоритет в этом вопросе принадлежит американским ученым. В 1943 году Херанг, в 1949 году Эндрес изучали этапы дегенерации клеток под действием вируса, впоследствии названных цитопатическим действием (ЦПД). Живые и погибшие клетки хорошо видны в обычный световой микроскоп уже при малом увеличении. В 1952 году аме­риканские исследователи Дульбеко и Фогт разработали методику получения первично трипсинизированных культур клеток, которые сразу же получили широкое внедрение в практику медицинских и ветеринарных вирусологических лабораторий, биокомбинатов, би­офабрик и других учреждений.

  В последние 25-30 лет разработаны методики получения диплоидных,  перевиваемых,  суспензионных и других культур,  которые, более экономичны в вирусологической практике.

Культуры клеток применяются для:

  1.  Обнаружения вируса в исследуемом патологическом материале на ЦПД.

  2. Идентификации вируса, обнаружение специфических антител в исследуемых сыворотках крови и определение их титров по реакции нейтрализации на КК.

  3.  Накопления вируса для производства культуральных живых и убитых вирус вакцин.

  4.  Получения вирусных антигенов-диагностикумов для серологической диагностики вирусных заболеваний.

  5.  Постановки РГАд,  РЗГАд,  РН.

  6.  Изучения особенности дегенерации клеток (ЦПД) под действием различных вирусов.

Культуры клеток делятся на плазменные, однослойные первично  трипсинизированные, субкультуры, диплоидные, перевиваемые, суспен­зионные,  культуры переживающих тканей.

  1. Плазменные культуры клеток - это мелкие кусочки эмбриональной ткани, величиной 1-1,5 мм, залитые плазмой куриной крови, которая служит питательной средой для клеток.

  Живые клетки в питательной среде размножаются, отторгают мертвые клетки.

  Плазменные культуры клеток считаются подготовленными к работе, когда вокруг тканевых кусочков образуется ореол живых клеток,  которые используются для культивирования вируса.

 

  В последние годы плазменные КК применяются редко, т. к. в этой культуре много мертвых отторгнутых клеток, что затрудня­ет учет ЦПД.

  2. Однослойные первичные трипсинизированные культуры клеток - это клетки однократного применения. Они не пересеиваются на новую питательную среду. Срок жизни этих клеток в рабочей суспензии при температуре + 2°С - + 4°С 20-25 дней, в пита­тельной среде при температуре +37°С 5-6суток после об­разования клеточного монослоя. Монослой формируется через 2-4 суток в зависимости от исходного материала и других факторов.

  Исходная концентрация клеток для формирования нормального монослоя должна быть не ниже 500-600 тысяч в 1 мл питательной среды. Подсчет клеток проводится в камере Горяева по лейкоци­тарной формуле. В течение 1-2 часов клетки адаптируются к пи­тательной среде, затем в течение 2-3 суток активно размножаются образуя сплошной клеточный слой. Пробирки, флаконы, матрасы, баллоны с выросшим густым монослоем прозрачных клеток сразу не используют для вирусологической работы.

  Методика приготовления однослойных трипсинизированных  КК, весьма трудоемка. Люди 5-6 часов работают в стерильном боксе, в стерильных халатах,  масках у пламени спиртовки и тем не менее эти культуры клеток наиболее широко применяются в практике вирусологических лабораторий.

  3. Субкультуры - это линии первично трипсинизированных КК, которые можно 3-4 раза пересеивать на новую питательную среду и таким образом использовать их для работы в течение месяца.

  4. Диплоидные культуры клеток - это особые клетки, выделенные из организма животных, имеющие диплоидный (двойной) набор хромосом. Они очень жизнестойкие и их можно пересевать (перевивать) из одной среды в другую в течение 5-6 месяцев.

  5. Перевиваемые культуры клеток - это клетки мутанты, выде­ленные из организма животных, обладающие способностью к ак­тивному, не ограниченному размножению на специальных пита­тельных средах. Их можно перевивать (пересеивать) из одной среды в другую бесконечно долго,  что делает эту культуру клеток очень удобной живой лабораторной моделью для культивирования многих вирусов.

  Первые линии перевиваемых КК были получены из доброкачест­венных и злокачественных опухолей. Однако опухоли имеют ви­русное происхождение, т. е. инфицирование опухолеродными виру­сами, поэтому опухолевые клетки применяются редко. Ученые по­лучили специальные перевиваемые линии клеток, обладающие такой же высокой скоростью беспредельного размножения, как и опухолевые клетки,  но они свободны от вирусной инфекции.

  6. Суспензионные культуры клеток - это клетки, которые активно размножаются в питательной среде, но не фиксируется на стекле, т. е. не образуют клеточный монослой, а накапливаются во взвешенном состоянии в среде. Они также являются хорошей живой моделью для культивирования вируса.

  Все культуры клеток выращиваются в специальной ростовой пи­тательной среде в термостате при температуре 37°С. После образования монослоя через 5-6 суток клетки стареют и погибают в результате интенсивной дегенерации и накопления продуктов клеточного обмена. Поэтому выросшие КК сразу же пускают в работу. Продлить жизнедеятельность клеток на 5-10 суток можно путем помещения их в условия холодильника при температуре + 2°С - +4°С. Не использованные культуры перевиваемых и диплоидных клеток, через каждые 8-10 дней хранения перевивают на новую питательную среду для поддержания этих клеток в рабочем состоянии.

  Питательные среды для КК бывают естественными и искусствен­ными, ростовыми и поддерживающими. Естественной питательной средой для некоторых клеток являются коровий эмбриональный экстрат, коровья амниотическая жидкость. В настоящее время естественные питательные среды для КК не применяются, а ис­пользуются специальные искусственные среды. Искусственные пи­тательные среды имеют сложный состав, содержат более 60 раз­личных компонентов: макро, микроэлементов, ростовых факторов, набор необходимых аминокислот, углеводов, витаминов, гормонов и т. д. Прообразом искусственных питательных сред для КК явилось молозиво, которое содержит все необходимое для питания новорожденных, их роста и развития. Однако до настоящего времени качественный и количественный состав компонентов молозива изучен не достаточно, а поэтому питательные среды для КК не могут в полной мере заменить среду живого организма, поэтому клетки сравнительно быстро стареют и погибают.

  Ростовые питательные среды содержат белок, который обеспе­чивает рост и развитие клеток.

  Поддерживающие питательные среды не содержат белка, клетки в этой среде не размножаются, а только сохраняют жизнеспособность. Поэтому выращивают клетки (КК) в ростовой питательной среде, затем, когда сформируется сплошной клеточный монослой, ростовую питательную среду заменяют поддерживающей и дальнейшее размножение клеток прекращается.

  Биологическая промышленность выпускает поддерживающие среды, например: наша отечественная 0,5%;2%;5% гидрализат лактоглобулина, среда Игла и другие. Чтобы эти среды стали ростовыми к ним добавляют 10-15% стерильной сыворотки крови животных.

  Питательные среды для КК обычно подкрашены нейтральным красным, который при изменении рН по мере накопления продуктов обмена веществ клеток меняет цвет, что является сигналом для за­мены питательной среды и пересева.

  Кроме питательных сред для изготовления КК необходимы сба­лансированные солевые растворы – фосфатно-буферный раствор, раствор Хенкса, в которых отмывают от крови (эритроцитов) тканевые кусочки, разводят вирус для заражения КК.

  Пропись фосфатно-буферного раствора состоит из 2 растворов "А" и "Б",  которые перед работой соединяют.

Техника приготовления однослойной первично трипсинизированной культуры клеток из фибробластов 9-10 суточных куриных эмбрионов.

  1.Путем овоскопии отбирают наиболее жизнеспособные эмбрионы, с активным сокращением и густой сетью кровеносных сосудов на хорионалантоисной оболочке карандашом отмечают пугу. Дальнейшая работа проводится в стерильном боксе, в халатах, масках, головных уборах, стерильными инструментами.

  2.Скорлупу эмбриона дезинфицируют и обжигают спиртом или ио­дированным спиртом. Затем срезают скорлупу по границе пуги.

  3.Пинцетом извлекают из яйца эмбрион и помешают его в чашку Петри с фосфатно-буферным раствором или раствором  Хенкса. От тушки отделяют голову, конечности, внутренности и тщательным ополаскиванием отмывают от эритроцитов, в 2-х порциях солевого раствора. В КК не должно быть эритроцитов, иначе ведь вирус после ее заражения адсорбируется на эритроцитах и не пойдет в клетки.