Лабораторные животные должны отвечать определенным требованиям:
1. Быть абсолютно здоровым, т. е. свободными от инфекции и инвазии.
2. Обладать стандартной чувствительностью (восприимчивостью) к определенным вирусам; лучше использовать животных одной линии.
3. Должны быть одинакового возраста (желательно молодые) и пола, породности, упитанности и массы тела.
Плохая упитанность животных, взъерошенный волосяной покров, катаральные явления (насморк, затрудненное дыхание), отказ от корма, понос и другие признаки дают основание предполагать о заболевании животного. В виварии лабораторных животных содержат в изолированных помещениях: 1) для чистых, т. е. здоровых; 2) для зараженных, т. е. больных. Кормление лабораторных животных должно быть строго по соответствующему рациону, содержание - соответствовать зоогигиеническим нормам.
Лабораторных животных используют для:
обнаружения вируса в патматериале; первичного выделения вируса из патматериала; накопления вирусной массы; поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии;титрования вируса;
получения гипериммунных сывороток; в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации.Перед заражением всех животных маркируют различными методами: 1) кроликам выстригают шерсть на спине и боку, на ушах делают насечки и дырочки, закрепляют бирки; 2) морских свинок различают по пятнам и окраске, выстригают шерсть на спине; 3) птицам навешивают бирки на крылья, надевают кольца с номером на ноги; 4) мышам и крысам на кожный покров наносят краску на места, соответствующие порядковому номеру, ампутируют пальцы (мышатам).
Перед заражением животное фиксируют, при необходимости выстригают шерсть, обрабатывают спиртом место инъекции. Суспензией инфицированного материала заражают лабораторных животных и учитывают реакцию на заражение. В вирусологической лабораторной практике для диагностики бешенства ставят биопробу на мышатах, инфекционный бронхит кур диагностируют на цыплятах и т. д.
Методы экспериментального заражения лабораторных
животных.
Вируссодержащий материал может быть введен лабораторным животным различными методами. Наиболее часто используются заражения: подкожное (п/к), внутрикожное (в/к), внутримышечное (в/м), внутрибрюшинное (в/б), внутривенное (в/в), интраназальное (и/н), интрацеребральное (и/ц). Однако в каждом конкретном случае исследователь стоит перед выбором введения материала каким-то одним способом.
Выбор метода заражения определяется тропизмом вируса. Под тропизмом вируса понимают способность его репродуцироваться в определенных типах клеток организма. Вирусы, репродуцирующиеся в нервных клетках, называются нейротропными (например, вирус бешенства), репродуцирующиеся в клетках кожи - дермотропными (например, вирус оспы), в клетках легких - пневмотропными (вирус гриппа). Вирусы, способные репродуцироваться в нескольких типах клеток, называются политропными (вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в клетках органов дыхания и размножения), а во всех типах клеток - пантропными (вирус чумы собак).
Зная тропизм вируса, материал вводят в органы, содержащие чувствительные к этому вирусу клетки. Например, вирус гриппа вводят интраназально, вирус оспы - внутрикожно, вирус бешенства - интрацеребрально. Пантропные вирусы лучше разносятся по организму при введении их внутривенно или внутрибрюшинно.
Если же исследователь не имеет данных о тропизме находящегося в материале вируса, то заражают животных нескольких групп разными методами.
Объем заражающей дозы материала значительно варьирует в зависимости от метода внесения и вида животных (0,1-5,0 мл).
Очень часто при первичном заражении не выявляется вирус, тогда через эти же биологические системы осуществляют второй и третий пассажи вирусов - «слепые пассажи». При отрицательном результате трех пассажей исследования по выделению активных форм вирусов прекращают. Под пассажем понимают заражение чувствительной живой системы с целью получения от нее новой популяции вируса.
За зараженными животными ведут наблюдения, отмечая изменения в их поведении, появление специфических симптомов болезни в соответствии с инкубационным периодом данной инфекции.
Действие вируса проявляется на лабораторных и естественно-восприимчивых животных следующим образом: 1) гибелью через определенный период времени; 2) развитием клинических признаков болезни; 3) патоморфологическими изменениями в органах и тканях павших животных.
Известно, что фильтрующиеся вирусы в отличие от микробов не развиваются на искусственных питательных средах. Поэтому для культивирования их применяют другие методы: используются лабораторные модели культуры клеток, лабораторных животных и куриные эмбрионы.
В последнее время очень часто для культивирования вирусов применяют куриные эмбрионы (КЭ). Они имеет ряд преимуществ перед лабораторными животными:
Курные эмбрионы в большинстве случаев свободны от возбудителей спонтанных, скрытых вирусных заболеваний КЭ и в вирусологических лабораториях применяется с целью:
Выделения вируса из исследуемого материала. Накопления вируса путем пассажа. Проведения серодиагностики. Получения живых и убитых эмбрион - вакцин. Изучения свойств вирусов.Куриные эмбрионы с успехом можно применять и для культивирования хламидий, риккетсий, бруцелл и других микроорганизмов.
Свежее племенное яйцо для КЭ желательно отбирать крупное с непигментированной скорлупой (лучше от кур породы Леггорн), от крупного эмбриона можно больше собрать вируссодержащего материала, и в нем хорошо видны при овоскопии эмбрион и пуга. Кроме того эмбрионы породы Леггорн легко заражаются и неприхотливы к условиям инкубации.
Эмбрион должен быть не старше 7-9 суток, иначе будет большой отход при заражении.
Инкубацию производят при температуре +37°С - +38°С и относительной влажности 40-50% и яйца переворачивают 2-3 раза в день.
Зародыш формируется в яйце еще в утробе курицы. В 1-2 дня инкубации закладывается головной и спинной мозг, а также скелетная мускулатура. На 2-ой день закладывается сердце, кровеносные сосуды, нервы, а в дальнейшем половые железы. На 5-ый день бурно развивается головной мозг, появляются пигменты зрачка. На 8-е сутки эмбрион уже похож на цыпленка. На 9-10 сутки появляется пушок, а на 13-е сутки пух и ясные контуры цыпленка.
Схема строения КЭ в возрасте 7-9 дней
1 — скорлупа; 2 — подскорлупная оболочка; 3 — хорионаллантоисная оболочка; 4 — аллантоисная полость; 5 — желточный мешок; 6 — белок; 7—воздушная камера; 8 — тело зародыша; 9 — амниотическая полость
Под скорлупой находится перепончатая или подскорлуповая оболочка, которая у тупого конца раздваивается - один слой идет под скорлупой, окаймляя пугу (воздушную камеру), а другой над белком. Примерно в центре развивается эмбрион. Последний окружен аминионом, с противоположной стороны от аминиона находится желточная полость (мешок).
С 3-го дня начинает развиваться аллантоисная полость, где скапливаются продукты обмена КЭ, он огибает желток, распространяется к тупому концу, огибает зародыш и срастается с хорионом, располагающемся под скорлуповой оболочкой и образуется хорионаллантоисная оболочка. В остром конце яйца будет остаток белка, а в тупом пуга.
Через хорионаллантоисную оболочку осуществляется газообмен. Желток является главным резервуаром питательных веществ для зародыша. В аллантоис впервые дни выделяются продукты обмена веществ эмбриона, а по мере рассасывания белка аллантоис является поставщиком воды и минеральных веществ. Амнион служит буферной камерой для эмбриона. По мере роста и развития эмбриона объем желтка и белка уменьшается, а аллантоисная и амниотическая полость увеличивается.
Для заражения используют эмбрионы в возрасте 7-12 суток. Раньше 7 дней эмбрионы мелкие и плохо проводить заражение, а старше 12 дней КЭ не рекомендуется использовать, во - первых, потому что жидкость полостей мутнеет и при хранении ее соли оседают в виде хлопьев, на которых также может адсорбироваться вирус. Во - вторых, на коже эмбриона появляется пушок, на котором также может адсорбироваться вирус.
Важным условием при работе с КЭ является соблюдение асептики. Необходимо предотвратить попадание в яйцо микробов. Если микробы попадут в яйцо, то они быстрее разовьются, чем вирус, и эмбрион может погибнуть еще до накопления вируса. Поэтому необходимо соблюдать следующие правила:
В лаборатории должны быть бокс с бактерицидными лампами и ионизатор, перед работой с КЭ бокс следует подвергать обработке этими лампами в течение 2-3 часов. Пользоваться только стерильными инструментами. Работа в боксе проводится в халатах, головных уборах. Строго соблюдать правила предварительной обработки скорлупы.Перед заражением необходимо убедиться в жизнеспособности эмбриона. Для этого в затемненной комнате проводят овоскопию. Если эмбрион жив, то он будет смещаться, сокращаться. Можно различить туловище, глаза (темное пятно правильной округлой формы). Сосуды красные, хорошо наполненные кровью, иногда видна пульсация крупных сосудов. Если эмбрион погиб, то он не шевелится, мертвый эмбрион темнее, сосуды темные, эмбрион "болтается". При овоскопии отмечают простым карандашом контуры пути, а крестиком предлежание эмбриона - глазок. Иногда можно отметить крупные сосуды и некоторые полости.
Методы заражения куриных эмбрионов
Перед заражением КЭ скорлупа на месте вскрытия или инъекции обрабатывается спиртом, обжигается, затем обрабатывается 5% раствором йода и вновь обжигается. Можно обрабатывать йодированным спиртом. Только после этого делаем прокол или вскрытие скорлупы. Методов заражения КЭ много, основные из них следующие:
1. Заражение на хорион - аллантоисную оболочку. КЭ должен быть 7-10 дневного возраста. На хорион-аллантоисной оболочке можно культивировать вирусы оспы, ящура. Доза заражения - 0,1 мл. Имеются три метода заражения на хорионаллантоисную оболочку:
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
