Округление - потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).
Симпластообразование - растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.) Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.
Таким образом, ЦПД - это погибающие или погибшие клетки под действием вируса. Такие же дегенеративные процессы под действием вируса проходят и в клетках больных животных и людей.
Классификация ЦПД по Эндерсу включает 3 типа дегенерации в клетках.
1-й тип-набухание и округление инфицированных клеток с последующим появлением в них их цитоплазме выраженной зернистости, за счет фрагментации ядра и скопления продуктов нарушенного клеточного обмена. Затем эти клетки разрушаются.
2-й - образование цитоплазматических и внутриядерных включений с последующим разрушением клеток.
3-й - характеризуется образованием гиганских многоядерных клеток симпластов, за счет слияния нескольких разрушенных клеток с цитоплазматическими и внутриядерными включениями.
Один вирус может вызвать дегенерацию клеток по 1 типу, другой по 2 типу и т. д. Эти изменения настолько характерны, что становится возможным не только определить наличие вируса в клетке, но и до некоторой степени судить о принадлежности вируса к тому или другому семейству.
Профессор Анджепаридзе внес существенные дополнения в оценку ЦПД, уточнил и детализировал этапы дегенеративных изменений в пораженных вирусом клетках.
1.Набухание и округление клеток.
2.Появление в цитоплазме мелкой зернистости.
3.Появление в цитоплазме крупной зернистости.
4.Выпадение пораженных клеток из монослоя.
5.Фрагментация ядра.
6.Распад клеток образованием гиганских многоядерных клеток за счет слияния отдельных разрушенных клеток.
7.Отсутствие видимых дегенеративных изменений в клетках (латентная вирусная инфекция).
При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).
Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к «слепым» пассажам. Необходимо провести не менее трех «слепых» пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.
ЦПД используется для:
1.Обнаружения вируса в исследуемом материале.
2.Титрация или количественного определения вируса (ЦПД 50).
3.Определения титра специфических антител в исследуемых сыворотках крови по реакции нейтрализации. (РН).
Однако есть вирусы, которые вызывают латентную (скрытую) вирусную инфекцию в клетке. Они размножаются в клетках, но видимой дегенерации в клетках при световой микроскопии обнаружить не удается. ЦПД или запаздывает или отсутствует. Для обнаружения таких вирусов в культурах клеток применяют люминисцентную вирусоскопию или ставят реакцию гемадсорбции (РГАд).
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ:
Студенты знакомятся с оборудованием бокса. Студенты знакомятся с методами заражения культур клеток вирусом. Студенты проводят микроскопию погибших зараженных культур клеток. Студенты знакомятся с методами заражения культур клеток вирусом. Студенты проводят микроскопию нормального монослоя культур клеток. Студенты оценивают ЦПД монослоя культур клеток под действием вируса.КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ:
Как проводят подбор культур клеток для заражения их вирусом? Каковы методы заражения культур клеток вирусом? Какие культуры клеток используют при нкубировании определенных вирусов? Что такое ЦПД вируса? Каковы изменения в монослое клеток под действием вируса? Как оценивается ЦПД вирусов?ЛИТЕРАТУРА
а) основная литература
Белоусова, вирусология: Учеб. [для вузов] / , , .– М.: КолосС, 2007. – 423 с. Белоусова, по ветеринарной вирусологии / , , . – М.: КолоС, 2006. – 248 с. Госманов, вирусология / , , – С.-П.: «Лань», 2010. - 480 с. Тихонов, : Учебник / , , . – СПб: Гиорд, 2005. – 780 с. Тихонов, по биотехнологии: Учебно-методич. пос. / , и др. – М.: Изд-во «», 2010. – 330 с.б) дополнительная литература
1. Дорофеев, метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для диагностики инфекционных заболеваний. Учебно-методическое пособие / , , – Ставрополь «АГРУС», 2008. – 32 с.
2. Дорофеев, иммуноферментного анализа и применение их в вирусологических исследованиях. Методические указания / , , – Ставрополь «АГРУС», 2008. – 36 с.
3. Щелкунов, инженерия / . Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2004. – 496 с.
ОГЛАВЛЕНИЕ
Занятие 1. Знакомство с работой и оборудованием вирусологической лаборатории. Техника безопасности при работе с вирусами. Схема вирусологических исследований……………… 3
Занятие 2. Отбор, консервирование и транспортировка патологического материала. Приготовление рабочей суспензии. Методы очистки и концентрации вирусов в исследуемом материале………………………………………………………………….8
Занятие 3. Световая вирусоскопия.......................................................20
Занятие 4. Люминесцентная вирусоскопия и методы флуорохромирования препаратов……………………………………...24
Занятие 5. Электронная вирусоскопия………………………………28
Занятие 6. Культивирование вирусов в организме лабораторных животных. Культивирование вирусов в эмбрионах кур. Схема эмбрионов кур. Освоение методов заражения эмбрионов кур………34
Занятие 7. Отбор вирусосодержащего материала от погибших эмбрионов кур и дальнейшая работа с вирусосодержащим материалом………………………………………………………………42
Занятие 8. Культивирование вирусов на культуре клеток…………44
Занятие 9. Методы заражения культур клеток. Цитопатогенное действие вируса на клетку……………………………………………...51
ЛИТЕРАТУРА ……………………………………………… 57
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 |
