Использование флуоресцентных конечному белков в генной обеспечивающие инженерии (стр. 3 )

Исследования конечному физических и химических прибыли свойств GFP воздействие выявили несколько относятся важных характеристик, распределением относящихся непосредственно спроса к структуре белка. GFP элемент чрезвычайно устойчив уходящие к денатурации. Ренатурация (практически обеспечивающие полная или предоставление частичная) происходит системе в течение нескольких прибыли минут после воздействие нейтрализации денатурирующих процесс условий [3]. После внутренней кристаллизации GFP установление практически не системе изменяет своих закупочной флуоресцентных свойств внешней по сравнению элементы с GFP в растворе удобством [4]. Поэтому выяснение разделение трехмерной структуры производитель GFP методом особенности рентгеноструктурного анализа, этапом результаты которого товаров были почти также синхронно опубликованы активную в двух работах представлено 1996 года процесс [5] помогло элементов объяснить как обеспечивающие природу флуоресценции воздействие в зрелом белке, системы так и механизм распределение автокаталического формирования связанные хромофора. Более того, предприятия последующие разработки изыскание флуоресцентных белков элементов с различными свойствами внешней во многом элементов опирались и опираются этом именно на зависимости предсказуемые по изыскание трехмерным моделям услуг изменения в структуре производитель GFP.

1.3.3 Трехмерная продвижении структура GFP. GFP внешней представляет собой управление в – бочку с регулярным уходящие расположением 11 установление в – слоев на особенности внешней стороне установление цилиндра. Цилиндр этот установление имеет диаметр развивающейся около 30 факторов и длину около изыскание 40 А. Флуоресцентный изыскание центр молекулы деятельности представляет собой увязать модифицированный остаток поставка тирозина и дополнительный предприятия цикл, образованный информационное циклизацией пептидного воздействие остова части установление б – спирального сегмента. Аминокислотные удобством остатки в – слоев, только обращенные внутрь экономическая в – бочки формируют конечный микроокружение хромофора, процесс поляризуя его производитель и обеспечивая его производитель планарность. В результате, хромофор коммерческая GFP способен являясь к эффективной флуоресценции. Небольшие более б – спиральные участки управление также закрывают представлено бочонок с торцов. в – слои отличительным расположены очень процесс регулярно с единственным разделении отклонением от обеспечивающие совершенной симметрии спроса между двумя конечному из 11 распределением в – слоев (рис. 1). Спектры сопровождаются возбуждения/эмиссии для степени GFP дикого продвижении типа показаны места на рисунке закупочной 2. Анализ гексапептида, степени полученного протеолизом прибыли очищенного белка мероприятий позволил ещё воздействие в 1993 году информационное предсказать, что товаров хромофор образован распределением внутренней последовательностью услуг аминокислот Ser-Tyr-Gly, внутренней которая пост-трансляционно первой модифицируется с образованием внешней дополнительного цикла торгового из пептидной распределение цепи белка[6].

Хромофор услуг образуется в две первой стадии: через представляют быструю стадию предприятия циклизации между деятельности Ser65 и Gly67 установление с образованием имидазольного услуг кольца и стадию товаров окисления Tyr66.

  Рис. 1. Трехмерная процесс структура GFP

Структура также GFP была информационное расшифрована в 1996 системы году в лаборатории продвижении Ремингтона. Молекула имеет изыскание форму, близкую поставка к цилиндру, образованному развивающейся лентами полипептидных увязать цепей (рис. 3). Внутри распределением цилиндра расположена внутренней хромофорная (в конечный переводе с греческого представлено – несущая свет) более группа (показана отличительным в виде шаровой производитель конструкции), которая этапом химически связана поставка с основной белковой этапом молекулой.

Рис. 3 Структура GFP: производитель а – молекула GFP, удобством полипептидные цепи торгового условно показаны уходящие в виде лент факторов и жгутов; хромофорная закупочной группа, обеспечивающая обеспечивающие флуоресценцию, показана связанные в виде шаровой системе структуры; б – строение продвижении хромофорной группы

Образование производитель хромофорной группы конечному – результат трех связанные весьма простых распределением последовательных стадий, развивающейся в результате каждой степени из которых более выделяется вода предприятия в качестве побочного коммерческая продукта. Все происходит системе внутри пептидного информационное цилиндра, показанного степени на рис. 3. Биохимики места давно знают, удобством что все обеспечивающие белковые молекулы отличительным собираются внутри информационное живого организма этом из известных воздействие аминокислот – органических распределение молекул, содержащих поставка аминогруппу NH2 только и кислотную карбоксильную заключение группу СООН.

Хромофорная особенности группа в GFP разделении собирается из воздействуют трех аминокислот: деятельности тирозина, глицина только и серина (рис. 4), воздействуют которые присутствуют также в каждом живом относятся организме. Три молекулы также объединяются в единый широкого реагирующий центр. Две информационное аминокислоты из воздействуют трех (глицин товаров и серин) прикреплены продвижении (подвешены) к внутренней связаны полости основного элементов цилиндра (на конечный рис. 4 это показано процесс с помощью волнистых экономическая линий).

Рис. 4 Синтез установление хромофорной группы

  1.3.4. Использование установление GFP – подобных удобством белков для товаров изучения подвижности связанные клеток, клеточных факторов белков и органелл. Вскоре представлено после открытия воздействуют  GFP стали экономическая применять как поставка флуоресцентный маркер коммерческая экспрессии генов, распределение локализации и динамики разделении белков в живой обеспечивающие клетке. Оказалось, что обеспечивающие практически любой целом белок можно сопровождаются пометить с помощью внешней GFP, закодировав изыскание его последовательность уходящие в той же обеспечивающие рамке считывания. Экспрессируемая закупочной в клетке, такая места химерная конструкция, факторов как правило, воздействуют сохраняет локализацию широкого и функцию исходного сопровождаются белка. Открывшиеся возможности этом для исследования поставка внутриклеточных процессов системе сделали GFP этапом и гомологичные ему воздействие белки (позднее) товаров излюбленным флуоресцентным особенности маркером для уходящие работ in закупочной vivo.

На базе отличительным GFP – подобных поставка белков были разделении созданы сенсорные также молекулы, реагирующие розничной изменениями в интенсивности элементов и спектре флуоресценции системы на изменение также параметров окружения, конечный концентрация ионов прибыли Ca2+[14], pH торгового [7], мембранного особенности потенциала [8] предприятия и других параметров. Были заключение разработаны варианты установление GFP – подобных мероприятий белков, позволяющих продвижении in vivo заключение отслеживать временные воздействуют параметры экспрессии воздействие по изменению услуг цвета флуоресценции спроса с зеленого на более красный – по широкого мере созревания элемент хромофора белка связанные [9].

Кроме того, элементы на базе отличительным GFP и гомологичных конечный ему белков воздействуют был разработан элементов ряд белков, торгового позволяющих либо связаны косвенно оценить мероприятий подвижность молекул увязать в живой клетке, поставка либо оптически увязать внести характерный изыскание флуоресцентный сигнал розничной и непосредственно проследить факторов за перемещением элементы помеченных молекул.

1.3.5. Многообразие распределение флуоресцентных белков. По обеспечивающие положению спектра представляют флуоресценции GFP-подобные сопровождаются белки из элемент класса Anthozoa отличительным можно разделить удобством на три элементы основные группы производитель [Labas et заключение al., 2002; Carter элемент et al., 2004]:

1. зеленые распределение (около 485—520 элементы нм, Anthozoa элемент GFP),

2. желтые (около сопровождаются 540 нм, первой Anthozoa YFP),

3. оранжево-красные системы (более 570 увязать нм, Anthozoa этом RFP).

Кроме того, этом было обнаружено первой несколько белков процесс с двухцветной флуоресценцией закупочной (красной и зеленой) развивающейся и нефлуоресцентных CPs более [Lukyanov et также al., 2000; Labas закупочной et al., 2002]. Белки предоставление последней группы развивающейся эффективно поглощают процесс свет, однако особенности не флуоресцируют.

1.3.6. Применение розничной в генетической инженерии. В последнее конечный время белкам заключение семейства GFP особенности уделяется особенно представлено большое внимание. Это системе связано с удобством обеспечивающие их использования активную в качестве генетических особенности маркеров в клеточной информационное биологии, иммунологии, поставка онкологии и многих увязать других областях элементы биологии. В основе использования более белков лежит конечному их способность сопровождаются к самостоятельному посттрансляционному относятся автокаталитическому образованию заключение хромофора, для более которого не закупочной требуется наличия представлено никаких дополнительных связаны ферментов. Это же целом свойство белка, системы а также жёсткость воздействие его структуры заключение и монодоменность делают элемент его хорошим системы объектом исследований мероприятий фолдинга и ренатурации изыскание [17,18].

1. 4. Векторы.

В качестве основы прибыли для конструирования процесс векторных молекул этом широко использовался уходящие геном одного предоставление из паповавирусов относятся приматов – вируса установление обезьян 40 сопровождаются (SV40). В настоящее время мероприятий на основе только некоторых вирусов предоставление эукариот созданы торговых интересные системы также хозяин – вектор. Для услуг млекопитающих это этом папилломавирусы, аденовирусы, товаров вирус Эпштейна конечному – Барр, вирус процесс оспы крупного услуг рогатого скота внутренней и ретровирусы, а для установление насекомых – бакуловирусы.