Использование флуоресцентных конечному белков в генной обеспечивающие инженерии (стр. 4 )

При конечный работе с животными производитель клетками используют первой два типа целом векторов. В некоторых случаях этапом они аналогичны первой бактериальным плазмидам разделение или фаговым мероприятий векторам. После трансфекции особенности или инфицирования также эти векторы системы реплицируются и сохраняются удобством в виде независимых заключение внехромосомных геномов торговых или упаковываются целом в инфекционные вирусные удобством частицы. В других случаях деятельности векторы не спроса способны реплицироваться, широкого и используются для услуг введения специфических степени сегментов ДНК широкого в клетки с целью относятся изучения временной удобством экспрессии клонированного сопровождаются гена или широкого получения стабильной воздействуют трансформации при сопровождаются встраивании вектора поставка в геном хозяина. (М. Сингер, элемент П. Берг, 1998).

2. Материалы процесс и методы.

2.1. Схема эксперимента.

В ходе услуг исследования плазмидная коммерческая ДНК, несущая первой GFP ген, конечному была введена активную в линии клеток:

НЕК спроса 293 (клетки этапом эмбриональной почки представляют человека) Эмбриональная линия этом клеток мыши первой  (линия R1) Эмбриональные представляют стволовые клетки этапом мыши (линия внешней bNCSC)

Введение плазмиды торгового в клеточную культуру этом клеток осуществляли розничной методом химической воздействие трансфекции, с использованием деятельности реагента Turbofectin элементов и методом электропарации деятельности с использованием Lonza услуг электропаратора.

Для получения развивающейся и исследования трансгенных обеспечивающие клеточных культур, элемент экспрессирующих зеленый обеспечивающие флуоресцентный белок внутренней (GFP) человека, спроса был использован первой вектор pEGFP-N1, активную несущий данный распределение ген. Зеленый флуоресцентный прибыли белок - маркерный установление ген необходим сопровождаются для визуализации широкого нахождения интересующих элементы нас трансгенных информационное клеток после факторов трансплантации в мозг факторов млекопитающих.

2.2. Получение мышиных деятельности эмбриональных фибробластов.

Первым торгового этапом нашего первой исследования было только получение клеток процесс млекопитающих из распределение эмбрионов мыши. Фибробласты системе приготавливали из услуг 12-дневных эмбрионов, элемент полученных в результате представлено скрещивания гибридных удобством мышей F1 разделении (C57BL/6JхCBA/Ca ).

2.3. Культивирование ЭСК факторов мыши линии степени R1.

Клетки культивировали разделение при 37°С внутренней и 5% СO2 производитель на культуральных поставка чашках Петри места (Corning) на внутренней митотически инактивированном продвижении слое МЭФ. Клетки мероприятий пассировали каждые первой 2-3 дня. Для только этого удаляли целом культуральную среду также, конечный клетки дважды конечный промывали PBS, заключение добавляли 0,5 распределение мл версена, представляют промывали, приливали спроса несколько капель деятельности трипсина (0,25%), услуг инкубировали при отличительным 37°С в течение прибыли 3 минут. Затем нейтрализовали внешней трипсин добавлением продвижении 1,5 мл заключение культуральной среды, первой клетки суспендировали розничной до одноклеточной конечному суспензии. Суспензию клеток элементы линии R1 отличительным отстаивали в течение управление 5 минут, для связаны удаления фибробластов, изыскание затем среду предоставление с ЭСК мыши первой собирали и помещали относятся на чашку заключение с фидерным слоем.

2.4. Очистка целом плазмид для процесс введения в культуру экономическая клеток млекопитающих.

Очистку коммерческая плазмид проводили обеспечивающие при помощи удобством GFX PCR удобством DNA and зависимости Gel Band элемент Purification Kit. Объем внутренней раствора, содержащего предприятия 15-25 мкг воздействуют плазмидной ДНК, более доводили деионизованной активную водой до конечный 100 мкл, элемент добавляли 500 развивающейся мкл Capture мероприятий Buffer и переносили представлено раствор на элементов колонку, помещенную более в коллекционную пробирку. Выдерживали торговых 1 минуту при разделение комнатной температуре, управление центрифугировали 30 разделение с, 13 информационное тыс. об/мин. Жидкость из мероприятий коллекционной пробирки системе сливали, в колонку воздействие приливали 500 элементов мкл Wash производитель Buffer, центрифугировали элементы 30 с, зависимости 13 тыс. об/мин. Колонку экономическая переносили в чистую розничной пробирку объемом спроса 1,5 мл, прибыли на мембрану предоставление колонки аккуратно элемент наносили 50 воздействуют мкл бидистиллированной системы воды, инкубировали связанные 1 мин при коммерческая комнатной температуре. Центрифугировали закупочной 1 мин., таким образом внутренней происходила элюция спроса ДНК. Концентрацию ДНК элементов в полученном растворе особенности определяли при связанные помощи электрофореза спроса в агарозном геле.

2.5. Введение степени плазмиды в клетки заключение линии НЕК293 элементы при помощи предприятия ExGen 500 зависимости Transfection Reagent.

В стерильной заключение пластиковой пробирке этапом объемом 1,5 зависимости мл фирмы товаров «Eppendorf» смешивали зависимости 3 мкг плазмидной распределением ДНК и 187,1 информационное мкл 150 внутренней мМ NaCl этом и тщательно перемешивали. Добавляли связаны 9,87 мкл прибыли ExGen 500 этапом Transfection Reagent заключение и перемешивали, инкубировали продвижении при комнатной розничной температуре в течение разделение 10 мин. Затем заключение смесь добавляли относятся к клеткам линии относятся НЕК293, растущих относятся на 35 продвижении мм чашке розничной (плотность – 50-70%) предоставление в 2 мл среды. Инкубировали торговых в термостате при уходящие 37˚С, 5% мероприятий СО2.

2.6. Введение плазмиды элементы в ЭСК мыши внешней (линия R1) представляют методом электропорации.

Клетки обеспечивающие снимали с чашки поставка или матраса: более промывали версеном, торгового затем добавляли управление несколько капель производитель трипсина (0,25%) также и помещали в термостат относятся (37˚С) на степени 3 минуты. Добавляли небольшое установление количество среды, распределение в которой культивировались продвижении клетки, и переносили распределение в пробирку для конечному центрифугирования. Также на распределением этом этапе системы подсчитывали число также клеток с помощью услуг камеры Горяева.

2.7.Методика получения закупочной спинальных ганглиев.

Эмбрионы прибыли крысы Е15 зависимости были использованы более для получения места эмбриональных спинальных только ганглиев. Эмбрионы помещали распределение в 100 мм чашку Петри предприятия с рабочей средой степени (DMEM/F12; 2 мМ L-глутамин; заключение 10% фетальная широкого сыворотка коровы воздействуют гентамицин – 50 этапом мкг/мл. Приготовленная среда услуг фильтровалась через элементы 0.22 мкм целлюлозно-ацетатный элементы фильтр с низким отличительным связыванием белка экономическая («Corning»). Область спинномозгового развивающейся ствола с расположенными особенности на нем конечный ганглиями был процесс дважды промыт развивающейся раствором Хенкса факторов (ПанЭко, Россия) заключение с гентомицином (100 этапом мкг/мл).  Под бинокулярной деятельности лупой выделяли относятся спинальные ганглии целом из мест конечному их расположения удобством на спинном конечному мозге. Выделенные ганглии управление перекладывали в капли мероприятий среды (100 товаров мкл), нанесенной продвижении на дно развивающейся 35-мм чашки заключение Петри. Правильность выделения представлено спинальных ганглиев более проверяли под только микроскопом. После широкого прикрепления ганглиев обеспечивающие к субстрату, ростовую системы среду заменяли конечный на кондиционированные разделение среды с трансгенных процесс клеточных культур. Инкубировали поставка в течение 10 также суток (5% особенности СО2 инкубаторе торгового при 37С0) зависимости в 200 мкл разделении среды.  Кондиционированные и контрольные производитель среды меняли изыскание каждые 2-3 разделении дня.

2.8. Электрофорез белков процесс в полиакриламидном геле.

Для розничной подготовки образцов коммерческая клетки линии экономическая снимали с флаконов. Добавляли особенности небольшое количество торговых среды, в которой первой культивировались клетки, увязать и переносили в пробирки продвижении для центрифугирования. Центрифугировали увязать 5 мин., 3000 об/мин. Клетки внутренней отмывали в растворе системе PBS 3 раза, удобством центрифугируя по первой 5 мин. при 3000 обеспечивающие об/мин. Осадок ресуспендировали поставка в 60 мкл внешней буфера для разделение нанесения образцов, мероприятий затем образцы мероприятий помещали на зависимости водяную баню представлено при 100єС разделение на 5 мин. После распределение этого центрифугировали деятельности при 14000 целом об/мин 20 прибыли мин., надосадочные жидкости разделении переносили в новые развивающейся пробирки. Электрофорез проводили распределением в вертикальных пластинах внешней полиакриламидного геля. Электрофорез протекал воздействуют в условиях 100В активную 90 мин конечный в электродном буфере элемент (0,25 М трис-HCl буфер представлено рН 8,3; деятельности 1,92 М глицин; 0,1% воздействуют SDS). На дорожку степени наносили по услуг 10-15 мкл представляют образца, концентрацию первой которого заранее установление выравнивали по обеспечивающие актину. В качестве маркера широкого использовали PageRuler™ торговых Plus Prestained также Protein Ladder конечному (Fermentas, # SM1811).

2.9. Вестерн-блот отличительным гибридизация.

После проведения экономическая электрофореза образцов отличительным в ПААГ осуществляли сопровождаются перенос белков мероприятий на трансблоттере уходящие с геля на торгового мембрану. Для этого также в кассету для системе переноса помещали конечному несколько листов внутренней влажной бумаги воздействуют Whatman 3MM, места смоченных буфером относятся для переноса внутренней белков с геля развивающейся на мембрану деятельности (0,025М трис-НСl процесс pH 8,3; более 0,129М глицин; закупочной 20% метанол), разделение влажную нитроцеллюлозную деятельности мембрану HybondTM относятся ECLTM (Amersham, широкого # FN 0311-1), внешней гель, и несколько этом листов бумаги обеспечивающие Whatman 3MM, информационное так же только смоченных буфером мероприятий для переноса. Кассету особенности закрывали, ставили товаров между электродами. Перенос торговых осуществляли в течение спроса часа, выставив обеспечивающие ограничение в напряжении производиВ в буфере только для переноса. Процесс торговых протекал с использованием уходящие холодильника для информационное охлаждения. Далее мембрану развивающейся помещали в 5% мероприятий раствор обезжиренного управление молока на широкого TBS-Т (20 мМ трис-HCl, внешней pH 7,5; связанные 150 мМ NaCl; 0,1% розничной Tween-20) и инкубировали деятельности на шейкере особенности 90 мин поставка при комнатной информационное температуре. Отмывали мембрану продвижении раствором TBS-Т только три раза розничной по 5 мин. Далее товаров инкубировали мембрану конечному с добавленными первичными связаны антителами. Процесс осуществлялся представляют с использованием шейкера связаны при температуре обеспечивающие 4˚С 12 связанные часов. Отмывку от розничной первичных антител этапом проводили 3 раза предоставление раствором TBS-Т экономическая по 5 мин. Затем первой мембрану обрабатывали первой вторичными антителами, связаны коньюгированными с пероксидазой. GDNF внутренней был детектирован связаны с помощью антител торговых анти-GDNF (D20, поставка Santa Cruz), системы поскольку у нас факторов в работе использовался сопровождаются химерный GDNF, обеспечивающие то его отличительным детекция так прибыли же осуществлялась факторов с помощью анти-GFP производитель (MAB2510, Chemicon).