Атрофия слизистой оболочки желудка при хроническом воспалении как общепатологический процесс и прогностический критерий канцерогенеза (стр. 2 )

При оценке экспрессии фактора желудочной дифференцировки Shh учитывали показатель интенсивности окрашивания цитоплазматической метки: 1 – слабая, 2 – умеренная, 3 – выраженная. Также оценивался процент позитивно окрашенных клеток от общего числа эпителиоцитов (≥1000 клеток) с подразделением на 5 градаций: 0 – до 5%, 1 – 5-25%, 2 – 26-50%, 3 – 51-75%, 4 – 75% и более позитивно меченых клеток. Оценку индекса экспрессии Shh вычисляли путем умножения показателя интенсивности окрашивания (1-3) на полуколичественно оцененную градацию (0-4) (Wang L.-H. et al., 2006; Waghray M. et al., 2010). Для статистической оценки различий с возможностью сопоставления индексов экспрессии в клетках желудочного и метаплазированного эпителия учитывали оценку маркеров Ki-67, Р53 и Cpp32 в цилиндрических каемчатых и муцинпродуцирующих клетках. Оценку экспрессии CDX-2 и Shh при кишечной метаплазии проводили суммарно в бокаловидных и цилиндрических клетках (Shiotani A. et al., 2008; Katoh Y. et al., 2009; Mutoh H. et al., 2010).

Для оценки уровня экспрессии желудочных (MUC 5AC, MUC6) и кишечного (MUC2) муцинов в слизистой оболочке желудка применялась полуколичественная шкала оценки интенсивности (0 – отсутствие, 1 – слабая, 2 – умеренная, 3 – выраженная). При этом поле зрения считалось пригодным для данной оценки признака при наличие в нем не менее 60% позитивно окрашенных клеток.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioskop 40 c использованием камеры AxioCam MRc5 и программного обеспечения AxioVision Rel. 4.7.2 (Carl Zeiss, Германия).

При оценке различия атрофических изменений (стадии хронического гастрита) между исследованными группами пациентов за значимый результат принималась одна ступень стадии из четырех возможных. Таким образом, минимальное различие выраженности атрофических изменений между двумя сравниваемыми группами должно составлять 25%. Исходя из этого утверждения, минимально достаточное число пациентов, рассчитанное по номограмме Альтмана ( и др., 2003), в исследовании должно составлять 24 в каждой группе, чтобы иметь 80%-ный шанс обнаружения значимой разницы при 5%-ном уровне значимости.

Для создания визуально-аналоговой шкалы градации атрофии слизистой оболочки желудка был проведен морфометрический анализ 20 микрофотографий – референтных изображений, опубликованных Международной группой Atrophy Club (Rugge M. et al., 2002). В соответствии с полученными данными построены пиктограммы, соответствующие 0-3 категориям выраженности процесса (рис. 2). Совмещением полученных пиктограмм с табличной оценкой стадии (0-IV) хронического гастрита, была разработана диагностическая таблица-шаблон.

Для расчета достоверности различий между счетными морфологическими признаками применялись непараметрические критерии, позволяющие обойтись без предположения о каком-либо распределении и имеющие вместе с тем достаточную степень чувствительности. В частности, для проверки нулевой гипотезы об отсутствии разницы между генеральными параметрами, оцениваемыми по выборочным показателям в случаях сравнения выборок с попарно связанными вариантами (до и после эрадикации) использовали парный W-критерий Вилкоксона ( 2007).

В случаях сравнения выборок, где варианты не имели парной связи применяли непараметрический U-критерий Манна-Уитни, критерий Краскела-Уоллеса и тест c-квадрат ( и др., 2003). Нулевой считали гипотезу о совпадении медианных значений двух независимых выборок. Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принимали р=0,05. При корреляционном анализе использовали определение коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rs).

Рис. 2. Шкала атрофии слизистой оболочки в теле и антральном отделе желудка, совмещенная с таблицей оценки стадии хронического гастрита.

Оценка сопоставимости результатов применения визуально-аналоговой шкалы в практике патологоанатомических исследований проводилась экспертным методом с использованием критерия согласия – каппы Коэна (k) (Landis J. R., Koch G. G., 1977). Группа патологов-экспертов работала в 2 режимах: на заочном этапе с использованием микрофотографий, на очном – с микропрепаратами. Для обработки результатов использовался расчет каппы Коэна методом квадратического взвешивания (Landis J. R., Koch G. G., 1977). Выбранному способу было отдано предпочтение в связи с тем, что по сравнению с линейным взвешиванием квадратическое чувствительнее оценивает различия, если эксперт выбирает более высокую градацию признака (Cicchetti D. V., Feinstein A. R., 1990; Jang B. I. et al., 2010). В нашем случае это III-IV стадии атрофии, при которых максимально высок риск возникновения рака желудка (Graham D. et al., 2010; Rugge M. et al., 2010).

Критерий согласия экспертов ранжирован следующим образом (Landis J. R., G. G. Koch, 1977; Morris J. A., 1994; Talebkhan Y. et al., 2009): менее 0,2 – плохое согласие, плохая степень согласованности; от 0,21 до 0,4 – удовлетворительное согласие (сносное), удовлетворительная степень согласованности; от 0,41 до 0,6 – умеренное согласие (среднее), умеренная степень согласованности; от 0,61 до 0,8 – хорошее согласие, хорошая степень согласованности; более 0,81 – очень хорошее (превосходное) согласие, очень хорошая степень согласованности.

Для расчетов использованы программы MedCalc 10.01.02 и SPSS 11.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Хронический гастрит

В группе атрофического H. pylori-позитивного антрум-гастрита пролиферативная активность мукоцитов слизистой оболочки желудка, оцененная по уровню экспрессии Ki-67 (табл. 3), была увеличена (р=0,002) при сопоставлении с группой сравнения. Отмечалось расширение пролиферативного компартмента с появлением меченых клеток как в покровно-ямочном эпителии так и в эпителии желез.

Во всех случаях отмечено уменьшение количества (объема) специализированных желез в сочетании со склерозом собственной пластинки слизистой оболочки, увеличением в ней количества ретикулиновых и реже –эластических волокон. Такие картины мы обозначили термином «абсолютная атрофия», то есть атрофия без метаплазии. Поскольку под атрофией в традиционном представлении понимают уменьшение объема желез в слизистой оболочке (с уменьшением количества специализированных клеток), при котором место утраченных желез замещается соединительной тканью – фиброз собственной пластинки ( и соавт., 1998). В связи с появлением представлений об атрофии как уменьшении количества специализированных клеток с заменой их метапластическим эпителием – метапластическая атрофия (Genta R. M. et al., 2008; Rugge M. et al., 2009), мы считаем целесообразным разграничить эти формы атрофии, назвав атрофию без метаплазии абсолютной атрофией, а за второй сохранив название «метапластической атрофии».

В 18 наблюдениях обнаружены очаги полной кишечной метаплазии. При полной кишечной метаплазии, как правило, имело место смещение зоны пролиферации вниз: большинство Ki-67 позитивных клеток располагалось в области дна желез. Смещение пролиферативного компартмента вполне соответствовало условиям перехода на вариант дифференцировки эпителия, более характерный для кишечника с расположением зоны пролиферации клеток в крипте. При неполной кишечной метаплазии (II и III типа), выявленной в 5 случаях, выделить пролиферативный компартмент как четко очерченную зону меченых клеток не представлялось возможным – метка Ki-67 встречалась во всех отделах желез.

По отношению к группе сравнения выявлено повышение (р=0,012) пролиферативной активности желудочного эпителия. Достоверных различий не было выявлено (р=0,072) при сравнении пролиферативной активности в желудочном и метаплазированном эпителии очагов полной кишечной метаплазии. По всей видимости, при антрум-гастрите, повреждение эпителия, приводящее к повышению его пролиферативной активности, является триггером универсальной гиперпролиферации при различных вариантах нарушенного клеточного обновления.

В отличие от группы сравнения при антрум-гастрите с атрофией желез наблюдали наличие более выраженной экспрессии Shh в мукоцитах слизистой оболочки антрального отдела желудка (р=0,024). Такой характер экспрессии можно оценить как частичное сохранение контроля дифференцировки в условиях активно пролиферирующей клеточной популяции (Wang L.-H. et al., 2006; Mutoh H. et al., 2010) при атрофическом антрум-гастрите. Частичное потому, что очаги кишечной метаплазии все-таки появляются.

Экспрессию Р53 при антрум-гастрите наблюдали в единичных мукоцитах желудочного эпителия и каемчатых цилиндрических клетках метаплазированного эпителия. Полная кишечная метаплазия характеризовалась наличием высокого уровня экспрессии кишечного фактора транскрипции CDX-2 – наличие во всех бокаловидных и каемчатых цилиндрических клетках. Во всех бокаловидных клетках при гистохимическом исследовании преобладали кислые сиаломуцины, иммуногистохимически определялась продукция кишечного муцина MUC2, по сравнению с желудочным эпителием экспрессия Shh была снижена.

В 8 случаях при атрофическом антрум-гастрите отмечали наличие экспрессии CDX-2 клетками желудочного эпителия в генеративном компартменте – в области перешейка желез.

Отмечена тенденция к снижению продукции MUC5AC при атрофическом антрум-гастрите, однако, достоверных (р=0,007) отличий от группы сравнения выявлено не было.

Таблица 3

Значения показателей клеточного обновления (индекс пролиферации, индекс экспрессии Р53, индекс апоптоза, индекс экспрессии CDX-2 и Shh) в группе хронического атрофического антрум-гастрита (min – наименьшее значение, LQ – нижний квартиль, Me – медиана (0,5 – квантиль), HQ – верхний квартиль, max – наибольшее значение)

отдел	показатель	min	LQ	Me	HQ	max
Индекс пролиферации
антраль ный отдел	ЖЭ	7	18	21	25	32
ЦКЭ	12	12	15	23	29
тело желудка	ЖЭ	5	7	7	12	15
Индекс экспрессии Р53
антраль ный отдел	ЖЭ	0	2	2	4	7
ЦКЭ	1	3	5	5	7
тело желудка	ЖЭ	0	0	0	0	0
Индекс апоптоза
антраль ный отдел	ЖЭ	22	23	27	30	32
ЦКЭ	17	29	30	38	43
тело желудка	ЖЭ	5	7	11	12	15
Индекс экспрессии CDX-2
антраль ный отдел	ЦКЭ	100	100	100	100	100
Индекс экспрессии Shh
антраль ный отдел	ЖЭ	2	6	6	9	9
ЦКЭ	1	2	3	4	4
тело желудка	ЖЭ	2	6	6	9	9

Условные обозначения: ЖЭ – желудочный эпителий, ЦКЭ – цилиндрический каемчатый эпителий в участках полной кишечной метаплазии.

В группе мультифокального атрофического гастрита в 23 случаях из 36 атрофия сочеталась с наличием убыли специализированных желудочных желез и метапластической атрофии – замещением клеток специализированных желудочных желез метаплазированным эпителием (кишечная и пилорическая метаплазия). В остальных 13 случаях имела место только абсолютная атрофия. При метапластической атрофии в 14 случаях имел место вариант с неполной кишечной метаплазией (5 случаев – тип III, 9 случаев – тип II). В условиях мультифокального атрофического гастрита по сравнению с атрофическим антрум-гастритом наблюдали увеличение пролиферативной активности эпителия слизистой оболочки желудка при наличие атрофии желез (табл. 4). Однако такая активность имела мозаичный характер, присутствовала не во всех железах, что и обусловило отсутствие различий между группой атрофического антрум-гастрита и мультифокального атрофического гастрита при сопоставлении показателей для желудочного эпителия в слизистой оболочке антрального отдела.

Таблица 4

Значения показателей клеточного обновления (индекс пролиферации, индекс экспрессии Р53, индекс апоптоза, индекс экспрессии CDX-2 и Shh) в группе хронического мультифокального атрофического антрум-гастрита (min – наименьшее значение, LQ – нижний квартиль, Me – медиана (0,5 – квантиль), HQ – верхний квартиль, max – наибольшее значение)

отдел	показатель	min	LQ	Me	HQ	max
Индекс пролиферации
антральный отдел	ЖЭ	14	16	22	25	33
ЦКЭ	18	27	32	39	44
ЦМЭ	22	32	42	43	45
тело желудка	ЖЭ	12	14	16	26	31
ЦКЭ	10	12	15	23	28
ЦМЭ	8	18	19	26	34
Индекс экспрессии Р53
антральный отдел	ЖЭ	3	6	12	12	14
ЦКЭ	4	10	11	15	15
ЦМЭ	4	8	8	10	12
тело желудка	ЖЭ	0	2	4	8	12
ЦКЭ	2	3	7	7	10
ЦМЭ	5	8	8	11	12
Индекс апоптоза
антральный отдел	ЖЭ	20	23	25	28	30
ЦКЭ	15	26	26	30	34
ЦМЭ	16	20	22	26	28
тело желудка	ЖЭ	18	20	22	24	29
ЦКЭ	19	21	24	28	33
ЦМЭ	22	25	28	31	34
Индекс экспрессии CDX-2
антральный отдел	ЖЭ	7	12	14	17	24
ЦКЭ	100	100	100	100	100
ЦМЭ	18	38	42	47	51
тело желудка	ЦКЭ	100	100	100	100	100
ЦМЭ	14	30	33	43	52
Индекс экспрессии Shh
антральный отдел	ЖЭ	2	6	6	9	9
ЦКЭ	1	2	3	4	6
ЦМЭ	9	9	12	12	12
тело желудка	ЖЭ	4	4	6	6	9
ЦКЭ	1	2	2	5	6
ЦМЭ	4	9	12	12	12

Условные обозначения: ЖЭ – желудочный эпителий, ЦКЭ – цилиндрический каемчатый эпителий в участках полной кишечной метаплазии, ЦМЭ – цилиндрический муцинпродуцирующий эпителий в участках неполной кишечной метаплазии.