На правах рукописи

Иммунологические аспекты ожоговой болезни

в клинике и эксперименте

14.00.36 – Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Владивосток – 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессио­нального образования «Владивостокский государственный медицин­ский университет Фе­дерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Федеральном государственном учреждении «Дальневосточный ок­ружной медицин­ский центр Федерального медико-биоло­гического агентства»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант:

Доктор медицинских наук, доцент

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент – доцент кафедры инфекционных болезней ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава».

Кандидат медицинских наук, доцент – заве­дующая краевым центром клинической иммунологии и аллергологии ГУЗ ККБ № 1, главный аллерголог-иммунолог министерства здравоохранения Хабаров­ского края, заведующая кафедрой гастроэнтерологии и клинической лабора­торной диагностики ГОУ ВПО и ИПКСЗ министерства здравоохранения Хаба­ровского края г. Хабаровска.

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «____»___________2009 г. в ____ часов на заседании диссер­тационного совета ДМ.208.007.02 при ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» г. Владиво­сток, ГСП, проспект Острякова, 2 (главный корпус)

НЕ нашли? Не то? Что вы ищете?

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «ВГМУ Росзд­рава» по тому же адресу (корпус 3)

автореферат разослан «____»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, доцент

 

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы: Проблема ожоговой травмы актуальна как для мир­ного, так и для во­енного времени. По данным ВОЗ термические поражения за­нимают 3 место среди про­чих травм, в России на их долю приходится 10-11%. По дли­тельности и тя­жести течения ожого­вая болезнь лидирует среди различ­ных вариантов травматиче­ской болезни. Ог­ромны мате­риальные затраты на ле­чение больных, высок процент инва­лиди­зации. Обра­щает внимание увеличение числа тяжелых термических травм с 35,7% 1990 г до 41,4% 2003 г ( с соавт., 2003). По­добная законо­мерность отмечается и в Примор­ском крае (, 2007).

Считается, что ожоговая травма с поражениями более 10-15% поверхно­сти тела со­провождается развитием ожоговой болезни (ОБ) и неспецифического син­дрома воспали­тель­ного ответа, которые часто приводят к син­дрому полиор­ганной недос­таточ­ности ( с соавт., 2005; Спири­донова Т. Г., 2007; Mythu, Kuzhali et. al., 2008). Разру­шающее термическое дей­ствие на ткани с поражением нервной системы при­водит к шоку с после­дую­щим развитием комплекса патологических процессов (, 2000; M. Bertin-Maghit, 2000; Venakatachalapathy T. S., 2007). Летальность при острой ожоговой токсемии мо­жет достигать 40-55%, а в стадию септикотоксемии – 45-65% (Мед­ников Р. В., 2002).

В то же время, ОБ следует рассматривать как иммуноде­фицитное за­боле­вание, при котором отмечается раннее и продолжительное снижение показате­лей врожденного и приобретенного иммунитета ( с соавт., 2008; D`Arpa N. et. al., 2007). Необходимо учитывать, что иммун­ный ответ у тяжело­обож­женных развива­ется на фоне острейшего дефицита энергетических и пла­стиче­ских ре­сурсов (, 2000).

Иммунный статус больных с тяжелой термической травмой фор­мируется на фоне большого числа иммуносупрессивных факторов: обширного поврежде­ния кожи как иммунного органа, стресса во время травмы, воздействия огром­ного количе­ства токсинов обожженных тканей, усиления пе­роксидации липи­дов и нарушения струк­туры мембранных систем клеток, воз­действия антибио­тикоте­рапии, многократных нарко­зов во время перевязок и операций аутодер­мопла­стики ( с соавт., 2003; Обы­денникова Т. Н. с соавт., 2003; с соавт., 2005).

Нарушение цитокинового баланса организма рассматривается в послед­нее время как важный механизм развития гнойной инфекции и сепсиса (Гор­динская Н. А., 2004; Сим­бирцев А. С., 2009; Kidd P., 2003).

На сегодняшний день имеется незначительное число работ, посвященных комплекс­ному изучению состояния иммунной системы у обожженных и роли их нарушений в пато­генезе ОБ и ее осложнений. Дальнейшее изу­чение имму­нопатогенеза, изменений в системе цитокинов – важнейших факто­ров врож­денного иммунитета при ожоговой травме является одним из ак­туаль­ных и пер­спективных направлений в комбустиологии. Понима­ние после­дова­тельности и выраженности иммунных нарушений, происходящих в орга­низме больных с ожоговой болезнью, позволит оптимизировать патогенетиче­скую те­ра­пию, сни­зить количество осложнений и летальность в поздние пе­риоды ОБ.

Цель исследования: выявить закономерности цитокиновой регуляции на раз­ных стадиях ожо­говой болезни в клинике и на экспериментальных животных, и дать экс­перимен­тальное обосно­вание иммунотропной терапии.

Задачи исследования:

1.  Определить уровни цитокинов ИЛ-2, 3, 8, 12(р70, р40), 10, ИФНγ, ФНОα, грану­лаци­тарно-макрофагального колониестимулирующего фак­тора (ГМ-КСФ) и рас­творимых рецепторов I типа ФНОα и рр ИЛ-2 в сыворотке крови обследуе­мых.

2.  Определить уровни острофазных белков (С-реактивного белка, α1-ки­слого глико­про­теина, α1-антитрипсина) в зависимости от тяжести и пе­риода ОБ в кли­нике.

3.  Разработать дополни­тельные иммуно-биохимические кри­терии опреде­ле­ния тяже­сти и предикторы небла­гоприятного прогноза у ожоговых боль­ных.

4.  Смоделировать ожоговую болезнь на экспериментальных животных и оп­реде­лить ка­чественно-количественные показатели фагоцитоза (ФИ, ФЧ) и со­стоя­ние кисло­родзависимых механизмов бактерицидности лей­коцитов (НСТ-тест).

5.  Определить уровни цитокинов (ИФНγ и ИЛ-10) в сыворотке крови мы­шей и уровни продуктов ПОЛ (первич­ных – диено­вых конъюгатов, и вторичных – три­енкетонов) и супероксиддисмутазы в дина­мике бо­лезни в экспери­менте.

6.  Оценить иммунологическую эффективность иммуномодулятора пептид­ной при­роды (ганглиина) при ожоговой болезни в эксперименте.

Научная новизна исследований:

Расширены представления о патогенети­ческой роли иммунных наруше­ний у обож­женных. Определены наиболее ин­формативные иммунологиче­ские мар­керы воспаления, которые можно исполь­зовать в ди­агностике, про­гнозе и оценке эффективности терапии.

Установлено недоста­точное вклю­чение противовоспалительной защиты на фоне системной вос­пали­тельной реакции (ста­бильный уровень ИЛ-10 на уровне контроля) и не­доста­точная активация защитно-приспо­собительных реакций (α1-АТ, осо­бенно, в группе тяжелообожженных к концу 3 недели).

Дано экспериментальное обоснование иммуномодулирующей терапии ганглиином в ранние периоды ОБ. Отмечено позитивное влия­ние ганглиина на пока­затели фагоци­тоза за счет усиления функциональной ак­тивности фагоци­тов. При­менение ганглиина не за­щищает от окислительного стресса, но оказы­вает моду­лирую­щее дейст­вие уже в раннем периоде, обеспечивая одно­времен­ное увеличение как первичных так и вто­ричных продуктов ПОЛ.

Практическая значимость работы: Проведенный комплексный анализ цито­кинового профиля и острофаз­ного ответа выявил различия и закономерно­сти иммунного ответа в зависимо­сти от тяжести и периода ОБ. Дефицит ИЛ-2 в пер­вые периоды ожого­вой болезни (1-3,10-14 сутки) на фоне увеличения рр ИЛ-2 при­водит к сниже­нию ак­тивации Th1 типа и усилению актива­ционно-ин­дуциро­ванного апоптоза. Дли­тельное и зна­читель­ное повышение СРБ также способ­ствует превалирова­нию Th2 типа им­мун­ного от­вета, что не является це­лесо­образ­ным защитно-приспо­собитель­ным меха­низ­мом.

Разработаны дополнительные диагностические и прогностические крите­рии харак­тера течения ожоговой болезни. Дефицит ИФНγ и, как след­ствие, усугубле­ние де­фекта Т-хелперов 1 типа является прогностическим предикто­ром раз­вития гнойно-септических осложнений и сеп­сиса (χ2=4,86). СРБ > 50г/л является дополнительным кри­те­рием тяже­сти больного на 10-14 и 21 сутки. Установлена сопряженность вы­сокой сте­пени низкого содержа­ния ГМ-КСФ < 5 пг/мл (χ2=14,726) и ИЛ-12р70 < 2пг/мл (χ2=17,769) в 1-3 су­тки, и высокого уровня ИЛ-8 > 300 пг/мл (χ2=7,957) на 21 сутки и СРБ > 100 г/л у тяжелообож­женных на 10-14 сутки (χ2=4,126) с неблаго­приятным про­гнозом.

Установлена прямая корреляционная связь между СРБ и ФНОα (r =0,6), СРБ и ИЛ-8 (r =0,8), а также отрицательная зависимость СРБ и ИЛ-2 (r=-0,58) и СРБ и ИНФγ (r=-0,53), что свидетельст­вует о длительном некомпенсиро­ванном системном воспалительном от­вете у тяжело­обожженных.

На основе результатов исследования разработаны и внедрены в учеб­ный процесс ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (г. Владивосток), ГОУ ВПО «ДВГМУ Росз­драва» (г. Хабаровск) мето­дические рекомендации: «До­полнитель­ные ди­агности­ческие критерии тяжести и прогноза течения ожого­вой бо­лезни». В ле­чебно-диагностиче­ский процесс крае­вого ожогового отделения ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России» (г. Владивосток) внедрены методы диагностики и рекомендо­вано вклю­чение иммуномодулирующей терапии у больных с ожоговой болез­нью.

Апробация материалов работы:

Основные положения диссертации были представлены на конгрессах и конферен­циях международного, российского и регионального уровня:

- Международный форум мо­ло­дых ученых и студентов. Турция, г.Анта­лия, 2004;

- III конфе­рен­ция «Фундаментальные и прикладные ис­следования в меди­цине». Гре­ция, г. Лутраки, 2005;

- III на­учная конференция с международ­ным участием «Приоритет­ные направ­ления развития науки, тех­нологий и техники». Египет, г. Хургада, 2005;

- XII российский национальный кон­гресс «Человек и лекарство». Мо­сква, 2005;

- V Конференция молодых ученых Рос­сии с международным участием «Фун­дамен­тальные науки и прогресс клинической медицины», Москва, 2008;

- II съезд комбустиологов России, Москва, 2008;

- VI, VII и IX Тихоокеанской научно-практи­ческой конференции студен­тов и мо­ло­дых ученых с международным уча­стием. Владивосток, 2005, 2006, 2008.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 16 научных работ, в том числе 1 статья в изда­ниях, рекомендованных ВАК; 1 методиче­ские рекомен­да­ции.

Структура и объем диссертации:

Диссертационная работа изложена на 141 странице компьютерного текста, иллюстри­ро­вана 22 табли­цами и 5 рисунками.

Работа состоит из введения, обзора литературы, опи­са­ния материа­лов и методов исследования, 3 глав, содержащих результаты соб­ствен­ных исследова­ний, заключения, выводов, практических рекоменда­ций, списка литературы, включающего 160 источников отечественной и 57 за­ру­беж­ных ав­торов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.  Ожоговая болезнь характеризуется развитием выраженного системного воспалитель­ного ответа. Ди­намика провоспалительных и колониестиму­лирующих цитокинов при ОБ свиде­тельствует о гиперактивации фагоци­тирую­щих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эн­доте­лиальных клеток.

2.  У тяжелообожженных не происходит адекватного включения противо­вос­палитель­ной защиты и недостаточна активация защитно-приспосо­би­тельных реакций. Дли­тельная гиперпродукция СРБ при тяжелом те­чении ожоговой болезни способствует превалированию Th2 типа им­мунного ответа и свидетельствует о длительном не­компенсированном системном воспалительном ответе.

3.  На модели ОБ в эксперименте показано, что применение ганглиина не за­щищает животных от окислительного стресса, но оказывает модули­рую­щее дей­ствие на процессы ПОЛ и фа­гоцитоза, влияя на уровень ИЛ-10, обладающего вы­раженными проти­вовоспалительными свойствами.

Личный вклад автора в проведённое исследование. Лично диссертантом был разработан план и проведена серия экспериментов по воспроизведению ОБ, выполнена оценка фагоцитарной активности нейтрофилов, кислородзави­симых механизмов бактерицидности и функциональных возможностей лейко­цитов, определен уровень содержания продуктов ПОЛ и уровень СОД, прове­дена оценка эффективности применения ганглиина в эксперименте.

В клинике диссертант непосредственно участвовал в обследовании и лече­нии большинства пострадавших, включенных в исследование, самостоятельно провел аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изу­чаемой проблеме, составил программу исследования, разработал карты обра­ботки медицинских документов, сбор и анализ данных, статистическую обра­ботку материалов, оформление диссертации. Количественная оценка цитокинов проводилась в лаборатории неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН под контролем к. х.н., с. н.с.

СОДЕРЖАНИЕ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы: Экспериментальная часть нашей работы выполнена на 100 самцах мы­шей-гибридов линии (СВАхС57В4)F1 массой 18-20 грамм. Жи­вотных содержали в вива­рии в соответствии с «Санитарными прави­лами по уст­ройству, оборудо­ванию и содержанию экспериментально-биологических клиник». Кор­мили в соответст­вии с нормами, утвержденными при­казом МЗ РФ от 01.01.2001 г. № 000. Исследо­вали животных в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 000 от 01.01.2001).

Все экспериментальные и клинические исследования проведены с разре­шения комитета по биомедицинской этике ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (про­токол № 8 дело № 61 от 01.01.2001).

Для моделирования ожоговой болезни мышам наносили глубокий ожог. Под эфирным нарко­зом с участков кожи спины и боковых поверхностей туло­вища выбривали шерсть, депи­лировали, обмывали теплым физиологическим раствором и выти­рали насухо. Далее на­носили термический ожог контактным методом. Получали ожого­вую рану площадью 30% поверхности тела, глубиной 3Б степени. Площадь рассчитывали по формуле Мее-Руб­нера (, 1973): S=K٠W2/3, где S – поверхность тела в квадратных сантимет­рах, К – коэф­фициент для мышей 11,4, W – вес животного в граммах.

Для выполнения поставленных задач было поставлено 2 серии опытов по 40 особей в ка­ждой: 1 серия – животные получали термический ожог 30% по­верхности тела, после чего внутрибрюшинно получали 0,5 мл 0,9% NaCl (группа сравнения);

2 серия - животные получали термический ожог 30% поверхности тела, после чего внутрибрюшинно им вводили ганглиин из расчета 0,1 мг/кг массы тела в 0,5 мл 0,9% NaCl (опыт или основная группа).

3 группа животных (20 особей) – служила контролем.

В эксперименте использовалась биологически активная добавка ганглиин, применяемая в вете­ринарии (соответ­ствует биологически активной добавке «Тинростим-СТ», Эп­штейн Л. М. с соавт., Пат. 2 2004).

Ганглиин вводили внутрибрюшинно из расчета 0,1 мг/кг массы тела. Стан­дартиза­ция дозы пре­парата, равноэффективной для мышей, в зависимости от массы тела и отно­сительной площади его поверхности рас­считывали по фор­м3).

Защитный эффект тинростима изучали по интегральным показате­лям, ха­рактери­зующим состояние факторов врожденного иммунитета: выжи­ваемости мышей, получив­ших ожог и средней продолжительности жизни. Процент (%) выживаемости, вычисляли по формуле: (число выживших мы­шей /суммарное число выживших и погибших мышей) х100%; среднюю про­должительность жизни (СПЖ) по формуле: сумма продолжительно­сти жизни всех мы­шей/число мышей в группе.

В крови проводили исследование: фагоцитарной активности нейтрофи­лов ( с соавт., 1999) с помо­щью полистерольного латекса (определяли индекс Гамбургера (ИГ) – процент фагоцити­рую­щих нейтрофилов и индекс Райта (ИР) – среднее число час­тиц фагоцитиро­ванных ка­ждым нейтрофилом), оценку кислородзависимых механизмов бактерицидности и функ­циональных резервных возможностей нейтрофилов (НСТ-тест) (Хаи­тов Р. М. с соавт., 1995), содержание продуктов перекисного окисления липидов оп­реде­ляли по методу (1989), состояние антиокси­дантной системы оценивали, определяя супероксиддисмутазу (СОД) в эритро­цитах по методу ­ренко (1988), уровень продукции ИНФ-γ и ИЛ-10 определяли с помощью спе­цифи­ческих реак­тивов для мышей фирмы «R&D Diagnostics Inc.» (mouse du­oset, USA), ме­тодом сендвич-варианта твердофаз­ного ИФА, на иммуно­фер­ментном анализаторе Mul­tiscan RS "Labsystems" (Финляндия) со­гласно прила­гае­мой инструкции.

Клинические и лабораторные данные исследованы у 84 больных с ожо­го­вой травмой и развившейся ожоговой болезнью в возрасте от 19 до 58 лет. Средний возраст больных соста­вил 38,3±1,2 года. Большая часть обследо­ван­ных была представлена лицами муж­ского пола (62чел/73,8%). Женщины со­ставляли 26,2% (22чел). Все по­стра­давшие, со­гласно классифика­ции ВОЗ, были распределены на 2 возрастные группы: от 18 до 44 лет (46чел/54,8%) и от 45 до 60 лет (38чел/45,2%). При диагностике глубины ожогов исполь­зовали приня­тую в России четы­рехсте­пенную классификацию, при этом учитывали ком­плекс данных, при рас­спросе по­страдавших, при осмотре (цвет кожи и об­на­женной дермы, наличие пузырей; наличие струпа, его цвет, плотность и под­вижность), а также при проведении диагностических проб.

При определении площади ожогов использовали «правило девяток», «пра­вило ла­дони», таблицы . Критериями тяжести термиче­ской травмы были общая площадь поражения, глубина ожогов (I, II, IIIА, IIIБ, IV), наличие или отсутствие термо­инга­ляционной травмы. Тяжесть ожо­говой травмы оценивали по индексу Франка (ИФ), где 1% поверхности ожога I-IIIА степени – 1 единица, а 1% – IIIБ, IV – 3 единицы. При сочета­нии травмы с по­ражением дыхательных путей, ИФ увеличивали на 15-30ед. Со­гласно ин­дексу Франка все больные были распределены на 2 группы: ИФ от 30 до 59 ед. – с сомни­тельным прогнозом (23чел/27,4%) и ИФ свыше 60 ед. – с неблагоприят­ным про­гнозом – 61 чел/72,6%.

Дополнительно в динамике оценивали состояние больных по клиниче­ским данным, тяжесть течения ожоговой болезни, наличие осложнений. Со­стояние больных оценивали исходя из клинико-лабораторных стандартов принятых в краевом ожоговом отделении ФГУ «ДВОМЦ ФМБА России» (физикальные ме­тоды, клинический и биохимический анализы крови, исследование системы ге­мостаза, электрокардиография, рентгенография органов грудной клетки).

Исходя из особенностей течения ожоговой болезни, забор крови произво­дили на 3, 10-14 и 21 сутки. На каждого больного запол­няли карту информиро­ванного согласия о включении в обследование (утверждено этическим комите­том ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава» (про­токол № 8 дело № 61 от 01.01.2001)). Для иммунологических иссле­дований использо­вали перифе­ри­ческую кровь больных, забор крови проводили в равных условиях (утром, на­тощак).

В комплекс лабораторного обследования больных помимо выше пере­чис­ленных об­щеклинических методов, включали оценку показателей цито­кино­вого профиля (ФНОα, ИЛ-2, 3, 8, 10, 12 (р70, р40), ГМ-КСФ, ИФНγ, а также растворимые ре­цепторы (рр I ФНОα и рр ИЛ-2)) и уровня остро­фазных белков (СРБ, α1-КГП, α1-АТ).

Концентрацию цитокинов (ФНОα, ИЛ-2, 3, 8, 10, 12 (р70, р40), ГМ-КСФ, ИФНγ, а также растворимые ре­цепторы (рр I ФНОα и рр ИЛ-2)) в сыво­ротке крови больных и людей контрольной группы определяли методом твер­дофаз­ного ИФА с использованием коммерческих тест-систем «R&D Diagnostics Inc.» (США), на Multiscan RC «Labsystems», в соот­ветствии с инструк­цией.

Определение концентрации СРБ и α1-антитрипсина проводилось с исполь­зова­нием реактивов «Sentinel Diagnostics» (Германия) спектрофотометрически при длине волны 340 нм микрометодом в нашей модификации (рационализа­торское предложение ВГМУ № 000 от 5.06.2000).

Определение концентрации αl-КГП проводили мето­дом ИФА по методике, описанной Т. Engvall на тест-системах фирмы «Pynatech» (Гер­мания), измеряли на спектро­фотометре фирмы «Multiscan» (Фин­ляндия), в соответствии с прила­гаемой инструкцией.

Для статистической обработки полученных данных проводили оценку па­раметриче­ских (t-критерий Стьюдента) и непараметрических (W-критерий Вилкоксона, z-критерий Манна-Уитни) показателей, для определения направ­ления и формы связи между отдель­ными качественными признаками, исполь­зовали метод χ2, кроме того, определяли коэф­фициент корреляции Пирсона и непараметрический коэффициент ранговой кор­реляции Спирмена с помощью программы «Биостат» (версия 4.03).

Динамика цитокинового профиля у больных с ожоговой болезнью.

В опубликованных различными авторами результатах исследований пред­ставлены неоднозначные данные по уровню и динамике про - и противо­воспа­лительных цитокинов после ожоговой травмы и чаще использована оценка ог­раниченного количества парамет­ров цитокинового статуса (Кон­ненков В. И. с со­авт., 2007). Производя отбор параметров цитокинового статуса нами было учтено, что при «классическом» воспалении основным источником цитокинов явля­ются лейкоциты и мак­рофаги воспалительного инфильтрата, а при систем­ном воспалении (СВР), лежащим в ос­нове ожоговой болезни, - активирован­ные эн­дотелиоциты и сосудистые макрофаги, что определяет более высокий уро­вень цитокинемии и требует исследования комплекса пара­метров, отра­жающих про­цессы активации разных клеток-мишеней. Для этих целей при СВР с соавт. (2008) предлагали анализировать ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10 и ФНОα. Мы посчитали целесообразным расширить этот спектр и включили в настоящее исследо­вание определение ФНОα, ИЛ-3, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-2, ИФНγ, ИЛ12(р70 и р40) и ИЛ-10.

Полученные нами данные свидетельствуют о существенном увеличении ранних про­воспалительных цитокинов в крови больных. Нами выявлено уве­ли­чение ФНОα от 3 до 100 раз, 3-4 кратное нарастание его раство­римого рецеп­тора I типа и 5-20 кратное повы­шение уровня ИЛ-8. Значительно возрастало также со­держание ГМ-КСФ. Это свидетельствует о гиперактива­ции фагоцити­рующих клеток и вовлечении в иммунный ответ эпителиальных и эндотели­альных клеток. Остальные исследо­ванные медиаторы изменялись мало. Можно лишь от­метить тенден­цию к сни­жению содержания ИЛ-2 и, напротив, к увеличе­нию его растворимого рецеп­тора. Нами не выявлено существенного различия показателей цито­ки­нового про­филя у мужчин и жен­щин (таблица 1).

Как указывалось нами, все пациенты были распределены по тя­жести со­стояния на 2 группы: средняя тяжесть (с ИФ от 30 до 59) и тяжело­обожжен­ные (с ИФ от 60 и выше). Оценка цитокинового профиля больных этих групп в динамике, соответст­вующей разным перио­дам ожоговой бо­лезни, позволила выявить целый ряд особенностей. Оказа­лось, что боль­ные с ожогами ИФ 30-59 в ранний период имели повышение ФНОα в 1,5-2 раза меньше, чем тяжело­обожженные (19,00±5,21 пг/мл против 43,61±16,32 пг/мл, р>0,05) с постепен­ным сниже­нием уровня этого цитокина в динамике. А на 21 сутки уро­вень ФНОα, хотя и оставался повы­шенным по сравнению с кон­трольной группой, но был стати­стически значимо ниже, чем у тяжелообож­женных (6,18±2,10 пг/мл против 0,59±0,32 пг/мл и 34,78±14,60 пг/мл). В то же время уро­вень раствори­мого рецептора ФНОα I типа у больных с ИФ 30-59 был достоверно выше не только по сравнению с контрольной груп­пой, но и с группой тяжелообожжен­ных больных в период ожогового шока и острой ожого­вой токсемии и только на 21 сутки со­держание рр I ФНОα снижалось, статистически не отличаясь от группы тяжелообожжен­ных, но в 2-2,5 раза превышая контрольные зна­чения. Вероятно, это один из важных меха­низмов ограни­чивающих функциональную ак­тивность ФНОα на фоне гиперпродук­ции по­следнего.

Таблица 1

Уровень цитокинов и их растворимых рецепторов у больных в ранний период ОБ

Иссле­дуе­мые по­каза­тели

Группы обследованных (М±m, пг/мл)

Статисти­ческая достовер­ность раз личий р1

Контрольная группа n=50

Больные с ожого­вой травмой n=84

Группа

мужчин n=62

Группа

женщин n=22

ФНОα

0,59±0,32

30,64±10,26**

48,56±15,80***

28,64±12,00**

>0,05

ррIФНОα

390,11±38,04

1096,34±43,21***

1194,30±30,60***

996,15±80,22**

<0,05

ИЛ-3

4,83±0,27

5,24±0,88

4,99±1,10

5,62±0,95

>0,05

ГМ-КСФ

10,85±2,75

20,42±3,16*

22,20±4,35*

20,83±3,15*

>0,05

ИЛ-8

5,47±1,49

89,47±27,11**

96,78±30,82**

86,00±36,92*

>0,05

ИЛ12р70

7,29±1,98

20,63±2,76***

24,18±4,12***

18,64±3,05**

>0,05

ИЛ12р40

151,84±39,23

168,17±20,34

158,32±15,00

186,39±36,40

>0,05

Кр70/40

0,05±0,01

0,13±0,02**

0,14±0,02***

0,12±0,03*

>0,05

ИЛ-2

1,85±0,56

0,8±0,3

0,62±0,09

1,00±0,40

>0,05

ррИЛ-2

559,18±12,18

728,64±79,06*

698,15±40,36***

824,82±124,50*

>0,05

ИФНγ

17,67±2,63

24,68±8,15

20,86±7,14

28,52±10,61

>0,05

ИЛ-10

16,64±2,09

24,81±5,12

22,81±4,06

26,17±8,82

>0,05

Примечание: статистическая достоверность различий с контрольной группой: р<0,05 - *, р<0,01 - **, р<0,001 - ***, рI – статистическая достоврность различий между мужчинами и женщинами

Содержание и динамика исследованных колониестимулирующих факторов (ИЛ-3 и ГМ-КСФ) также было различным у обожженных двух групп. У боль­ных со средней сте­пенью тяжести их уровень в 1-3 сутки был статистически значимо повышен, превышая контрольные значения в среднем в два раза с по­следующим умеренным (в 1,5-2,5 раза) увеличением к 10-14 суткам и таким же снижением к 21 суткам. Уровень ИЛ-8 в ранний период после термической травмы у пациентов с ИФ 30-59 был статистически зна­чимо повышен, с после­дующей стабильной динамикой на 10-14 сутки и сни­жением на 21 су­тки.

В 1-3 сутки ОБ зарегистрировано также повышение важ­ного цитокина макро­фагаль­ного происхождения ИЛ-12р70 (38,42±15,00 пг/мл против 7,29±1,98 пг/мл в кон­троле, р<0,05) тогда как уровень ИЛ-12р40 практически не отличался от референс­ных величин (188,34±30,46 пг/мл про­тив 151,84±39,23 пг/мл; р>0,05), что обеспечивало суще­ственное увеличение коэффициента со­отношения ИЛ-12р70 к ИЛ-12р40. В по­следующем опреде­лялось снижение уровня ИЛ-12р70 и регуляторного коэффи­циента. Как отмечено в работах (2001, 2007) подоб­ная дина­мика харак­терна для острых инфекций и травмы, в том числе термической.

Важным было оценить уровень и динамику цитокинов, отражающих акти­вацию и функцию Тh1 и Тh2 типа. У больных с термической травмой с ИФ 30-59 в ранние сроки уста­новлена тен­денция к снижению ИЛ-2, статистически значимое снижение уровня рас­творимого рецеп­тора ИЛ-2 в сыворотке крови. Последнее нами расценено как компенса­торный механизм на фоне относитель­ной недоста­точности ИЛ-2 – важного ростового фактора Т-лимфоци­тов. На этом фоне значение Тh1 маркерного цитокина (ИФНγ) мало от­лича­лось от контрольных показателей. В динамике на 10-14 сутки за­фикси­ровано только статистически значимое двукратное повышение уровня ИЛ,69±7,24 пг/мл против 20,47±9,16 пг/мл; р<0,05). А к концу третьей недели его количе­ство снижалось, не дости­гая, однако, уровня контрольной группы.

В группе тяжелообожженных больных (ИФ 60 и выше) в период ожо­гового шока вы­явлено увеличение уровня ФНОα – основного медиатора сис­темной воспалительной реак­ции, а также его растворимого рецептора, через кото­рый опосредуется и усиливается апоптоз Тh1 типа, что вероятно, приводит к им­му­нодефициту, связанному с нарушением клеточ­ного иммунитета и антите­лооб­разования. Одновременно фиксировали повышение уровня и ИЛ-8, из­быточная продукция которого стимулирует гиперактивность нейтрофилов. Свой­ства ИЛ-8 вызывать миграцию клеток и способность их к адгезии, опре­деляют его как ак­тивного участника острой воспалительной реакции. Фер­менты, высвобож­дающиеся из по­гибших нейтрофилов, вызывают повреждение тканей, что явля­ется до­полнительным фактором утяже­ления интоксикации и развития синдрома полиорганной недостаточности. Установлена прямая корреляционная связь ме­жду уровнем ИЛ-8 и лей­коцитарным индексом интоксикации (r=0,6; р<0,05). В то же время выяв­лен дефи­цит ИЛ-2, что ведет к снижению активации Тh1 типа и усилению их апоптоза. Значения других исследованных медиаторов мало от­личались от контрольных величин.

На 10-14 сутки после травмы зафиксировано усугубление дефекта Тh1, ха­рак­тери­зующегося дефицитом ИФНγ, что яв­ляется прогностическим предикто­ром развития гнойно-септических ослож­нений и сепсиса (χ2=4,86, р<0,01). Отме­чена ги­перпродукция ФНОα и рр I типа ФНОα, ИЛ-8. На фоне сохраняю­щегося дефи­цита ИЛ-2 выявлено досто­верное увеличение содержания рр ИЛ-2. Таким обра­зом, происходит нару­шение передачи сигнала, опосредованного ИЛ-2, как вследст­вие избыточного связы­вания ИЛ-2 с раство­римыми рецепто­рами, так и формиро­вания инду­цированной анергии из-за потери Тh этих ре­цепторов. Та­ким обра­зом, в ста­дию острой ожоговой токсемии формируется глубокий коли­чествен­ный и функциональный иммунодефицит Т-клеточного звена иммуни­тета.

К концу третьей недели определили сохраняющуюся гиперпродук­цию провоспа­ли­тельных цитокинов: ФНОα, ИЛ-8, растворимых рецеп­торов рр I ФНОα, ррИЛ-2 и де­фицит ИЛ-2. Повторный подъем уровня ИЛ-8 у тяжело­обожженных больных можно объ­яснить присоединением вторичных инфекций и развитием септикотоксемии. Выяв­ленный дефицит ИЛ-3 свиде­тельствует о глубоком угнетении пролиферации всех клеток крове­творения, в том числе красного кровяного ростка. При проведении корреляционного ана­лиза в этот период установлена прямая корреляционная связь средней силы (r=0,53; р<0,05) между ИЛ-3 и количеством эритроцитов. О тенденции к восстановле­нию функции Тh1 свидетельствует некоторое увеличение содер­жание в крови ИФНγ.

Содержание противовоспалительного цитокина – ИЛ-10 у пациентов этой группы на протяже­нии всего пе­риода исследований было стабильным (27,57±7,31 пг/мл – 24,40±7,85 пг/мл) и статистиче­ски значимо не отличалось от контрольной группы, что свидетельст­вует о том, что на фоне активации сис­темной воспа­лительной реакции не про­исходит включения системы противо­воспалитель­ной защиты у больных с тяжелым течением ОБ.

Среди обследованных нами людей с термической травмой умерли 6 чело­век (ле­таль­ность – 7,14%). Все с ИФ>60, следовательно, в группе тяжело­обож­женных летальность 9,84%. Для анализа сопряженности нарушений в системе цитокинов и летального исхода нами был применен метод χ2. Учиты­вая, что одним из веду­щих медиаторов воспалитель­ного ответа большинством авторов признается ФНОα, мы ретроспективно оценили его уровень в группах выжив­ших и умерших с тяжелой ожоговой травмой на 1-3 сутки. Про­веден­ный анализ не выявил сопря­женности высокого уровня ФНОα и летального исхода (χ2=0,946, р=0,33). Оценка коэффициента сопряженности в 1-3 сутки после ожога уровня ИЛ-8 и летального исхода также не выявила их взаимо­связи (χ2=0,037, р=0,646). Оце­нивая медиаторы, усиливающие функцию, преимуще­ственно, клеток макрофа­гального происхо­ждения – ГМ-КСФ и ИЛ-12р70 уста­новили сопряженность низ­кого уровня этих цитокинов в ранний период после ожоговой травмы с небла­гоприятным исходом. Степень сопря­жен­ности высо­кая и статистически значи­мая (ГМ-КСФ χ2=14,726, р=0,0001 и ИЛ-12р70 χ2=17,769, р=0,00001). Учитывая изменения значений ИЛ-8, нами проведена оценка сопря­женности его высоко уровня и летального исхода в динамике. По­лученные данные позво­ляют кон­статировать сопряженность вы­сокого уровня ИЛ-8 (>300пг/мл) у больных ожо­го­вой болезнью на 21 сутки исследования с неблагоприятным исходом (χ2=7,957, р=0,005).

Характеристика острофазного ответа у больных с ожоговой болезнью.

Для анализа из большой группы реактантов острой фазы было выбрано 3 протеина. Из класса I – СРБ и α1-кислый гликопротеин, первый из которых от­но­сится в норме к группе минорных (у здоровых людей практически не опреде­ляется), а при воспалении – к группе сильных белков. А второй – к группе бел­ков средней силы. Гены белков этого класса ре­гулируются ФНОα, ИЛ-1 и ИЛ-6. Из класса II определяли α1-антитрипсин, отно­сящийся к группе средних бел­ков, ин­дуцируемых ИЛ-6, но не ИЛ-1.

Выявлено существенное увеличение (в 500 раз) количества СРБ в ран­ний период ожоговой болезни. Его содержа­ние снижалось у больных к 10-14 суткам почти в 3 раза и оставалось на близком уровне до 21 суток. При этом и к 21 дню значения оставались в 200 раз выше, чем у здоровых лю­дей. СРБ относится к факторам врожденного иммунитета и благодаря сродству к фос­фо­липидам мембран участвует в элиминации поврежденных клеток из орга­низма. При этом его цитотропная активность распространяется на клетки, участвующие в ран­них реакциях защиты (нейтрофилы, моноциты) и на лим­фоциты.

Анализ изменений СРБ проведен у больных с разной степенью тяже­сти ОБ. В ран­ний период установлена однотипная реакция в обеих группах: резкое повышение (184,83±39,31 г/л и 202,17±22,06 г/л против 0,32±0,07 г/л). В даль­нейшем у обожженных средней степени тяжести СРБ снижался к 10-14 суткам (более чем в 5 раз) и продолжал снижаться к 21 суткам. У тяжело­обожженных СРБ к 10-14 суткам снижался лишь в 2 раза, а на 21 день зафик­сирована тен­денция к повторному повышению. При этом его уровень был в сотни раз выше, чем в контрольной группе и в десять раз превышал уровень у паци­ентов сред­ней сте­пени тяжести (рис.1). Несмотря на многочисленные пози­тивные меха­низмы действия СРБ, длительная (3 недели) его гиперпродукция у больных с тяжелой ОБ спо­собствует превалированию Тh2 типа иммунного ответа, что нельзя счи­тать це­лесообраз­ным защитно-приспособительным ме­ханизмом, особенно в пе­риод септикотоксемии. Это также подтверждается корреляцион­ными взаимо­связями в данном периоде: прямая сред­ней силы связь между уровнем СРБ и ФНОα (r=0,6, <0,05), сильная связь между СРБ и ИЛ-8 (r=0,82, <0,01) и отрица­тельная зависимость с ИЛ-2 (r=-0,58, <0,05) и ИФНγ (r=-0,53, <0,05). Получен­ные данные свидетельствуют о длительном некомпенсирован­ном систем­ном воспалительном ответе у тяжело­обожжен­ных больных, что по­зволяет считать высо­кий уровень СРБ одним из допол­нительных критериев тя­жести больного с ожоговой травмой: на 10-14 и 21 сутки СРБ>50 пг/мл (χ2=6,42, р<0,002, при 2 степенях свободы).

Рис. 1. Динамика СРБ (г/л) у больных с разной степенью тяжести ОБ.

Основными биологическими эффектами α1-кислого гликопротеина (α1-КГП) яв­ля­ются: способность связывать гистамин, ингибировать агрега­цию тромбоцитов, взаимо­дей­ствовать с фосфолипидами мембран. Он обла­дает также иммунокоррегирующими свойст­вами: предотвращает агрегацию нейтро­филов, снижает активность NK-клеток, на­рушает киллинг поверхно­стных им­муноглобулинов, уменьшает образование супероксид­ных ра­дика­лов, in vitro стимулирует пролиферацию клеток. Это позволяет считать, что α1-КГП обла­дает широким спектром биологических свойств, способных ог­раничивать пато­логи­ческий процесс. По данным литературы пик концентра­ции α1-КГП (при механиче­ской травме и ожогах) отмечается не ранее 3-4 су­ток (, 1992). По нашим данным, двукратное увеличение концентрации α1-КГП опре­деля­ется уже на 1-3 сутки и нарастает к 10-14 в 1,5 раза, оставаясь на близ­ком уровне к 21 дню. При этом в ранний период после травмы значения α1-КГП уве­личиваются в обеих группах ожоговых больных, хотя у тяжело­обожженных существенно выше (2,15±0,03 г/л против 0,89±0,15 г/л, р<0,001 в группе ИФ>60; 1,77±0,32 г/л против 0,89±0,15 г/л р<0,001 в группе ИФ 30-59). Эти раз­личия сохраняются и к 10-14 суткам (2,91±0,33 г/л против 1,84±0,21 г/л) и только к 21 суткам уровень остро­фазного белка становится практически рав­ным, в обеих основных груп­пах, пре­вышая значения кон­троля в 2 и более раз. Таким образом, оценка со­держания α1-КГП в сыво­ротке крови больных ОБ (на 10-14 сутки) с уровнем пре­вышающим 2,1 г/л служит дополнительным призна­ком тяжести состояния больного (рис. 2).

α1-антитрипсин (α1-АТ)–гликопротеид, относится к α1-глобулинам, со­ставляя около 90% их фракции, и дает около 90% антитрипсиновой активности сыворотки крови. Для начальных стадий острого воспаления обычно харак­терно сни­жение α1-АТ, вслед за этим происходит повышение концентрации, связанное с увеличе­нием синтеза этих белков, характер изменений не зависит от локализации про­цесса, а обу­словлен тяже­стью его течения (, 2001).

По нашим данным, у больных в ранний период ОБ количество α1-АТ по­выша­ется, но незначительно (2,40±0,12 г/л против 2,0±0,25 г/л в контроле). Су­щественное повы­шение отмеча­лось к 10-14 суткам (3,86±0,10 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 су­тки, р<0,001), что соответ­ствует нор­мальному течению защитно-приспособитель­ных ре­акций и, в целом, от­ражает адекватное участие антипротеаз при ОБ в пе­риод ток­семии. Однако к 21 суткам зафиксиро­вано су­щественное сни­же­ние уровня α1-АТ (2,10±0,09 г/л против 3,86±0,10 г/л на 10-14 сутки, р<0,001). Его уро­вень стал не только в 2 раза ниже, чем в пре­дыду­щем периоде, но и ста­тистиче­ски ниже, чем в ранний период ОБ (2,10±0,09 г/л против 2,40±0,12 г/л в 1-3 сутки, p<0,05), достигая уровня кон­трольной группы. Та­кая динамика не соответствует тяжелому состоя­нию мно­гих больных. По­этому проведен анализ уровня этого белка отдельно в группах средней сте­пени тяжести и в группе с тяжелым течением ОБ. У больных сред­ней степени тяже­сти динамика изменений α1-АТ соответствовала выше изло­женной, тогда как у тяже­лообож­женных уровень к 10-14 суткам практи­чески не изменился по срав­нению с ранним периодом (2,46±0,14 г/л против 2,57±0,25 г/л, р>0,05), а к 21 суткам снизился до уровня контрольных значений (1,79±0,15 г/л против 2,0±0,25 г/л в кон­троле) (рис. 2). Весьма вероятно, что относи­тельно низкий уровень α1-АТ от­ражает про­цесс его активного потребления при массив­ном повреждении тканей и, в то же время, свидетельствует о недостаточной акти­вации этого важного защитно-приспособи­тельного механизма, особенно в группе тяжелоболь­ных. Нам не удалось обнаружить ста­тистически значимых взаимосвязей α1-АТ с анализи­руемыми параметрами цитокинового профиля.

Проведя ретроспективный анализ уровня СРБ, α1-КГП и α1-АТ в крови умер­ших с ОБ, на 1-3 сутки после ожоговой травмы нами не было вы­явлено стати­стически значимых различий по сравнению с группой вы­живших больных с ИФ более 60. Тогда как на 10-14 сутки уровень СРБ>100 г/л сопряжен с не­благопри­ятным исходом в группе боль­ных с ИФ>60 (χ2= 4,126; р=0,001, при 1 степени свободы).

Рис.2.Динамика α1-КГП и α1-АТ (г/л) у больных с разной степенью тяжести ОБ.

Экспериментальное моделирование ОБ и механизмы кли­нико-имму­ноло­гичекой эффективности иммуномодулятора пептидной природы.

Учитывая уже установленные механизмы действия тинростима в зави­си­мости от ис­ходного состояния клеток (норма, иммунодепрессия, актива­ция) (, 2006) и его клинико-иммуноло­гической эффективности при ожогах средней степени тяжести (, 2006), представлялось важным провести экспериментальные ис­следования, которые позволили бы нивелиро­вать влияние других терапевти­ческих стратегий и определить, либо уточнить клеточные и молекуляр­ные механизмы действия иммуномодулятора пептидной природы на модели ожо­говой бо­лезни.

Анализ показателей фагоцитарной активности лейкоцитов крови мышей экс­пери­ментальных групп выявил значимую депрессию количественных показа­телей фагоцитоза (индекса Гамбургера (иГ) и индекса Райта (иР)). В первые сутки после травмы у мышей обеих групп (основной и сравнения) зна­чения иГ были в 2 раза ниже, чем в контрольной группе. Фагоцитар­ное число также статистически значимо было снижено. На третьи сутки по­сле травмы в опытных группах выявлена разнонаправленная динамика: у мышей ос­новной группы увеличился уровень фагоцитарной активности и фагоцитарное число, дос­тигая уровня показателей контрольной группы. К 10 суткам происходит значи­тельное уве­личение удельного веса фагоцитирую­щих клеток, тогда как фагоцитарное число изме­ня­лось мало. В группе сравне­ния выявлено усугубле­ние депрессии активности фагоцити­рующих клеток по показателю иГ на 3 су­тки. К 10 суткам за­фиксировано по­вышение зна­чений фагоцитарной активно­сти и по иГ, и по иР. Однако удельный вес фагоцитирующих лейкоци­тов был су­щественно ниже как по сравнению с контрольной группой, так и с ос­новной.

Интегральная оценка кислородзависимых механизмов бактерицидно­сти лейкоци­тов экспериментальных животных в НСТ-тесте выявила значи­мые из­менения показателей. В основной группе показатели спонтанного НСТ-теста (НСТ-спонт) в первые сутки после травмы пре­вышали значения контрольной группы в 1,8 раза (55,3±2,6 ОДх10-3 против 32,0±1,2 ОДх10-3, р<0,001) и были в 2 раза выше, чем в группе сравнения (55,3±2,6 ОДх10-3 против 27,0±1,0 ОДх10-3, р<0,001). Пока­затели индуцированного НСТ-теста (НСТ-индуц) мало отлича­лись от контроль­ной группы, но были выше, чем у мышей группы сравнения. Фа­гоцитарный ре­зерв (ФР) у мы­шей основной группы зна­чительно снизился в 1 сутки (0,82±0,04 про­тив 1,23±0,1 в контроле, р<0,001). На 3 сутки за счет снижения показателей НСТ-спонт (29,7±1,7 ОДх10-3 против 55,3±2,6 ОДх10-3, р<0,001) и менее зна­чимого снижения НСТ-индуц – ФР повы­сился до нор­маль­ных ве­личин (1,17±0,08 против 0,82±0,04 в 1 сутки, р<0,01). К 10 суткам увели­че­ние пока­зателей НСТ-индуц определяют тен­денцию к увеличению ФР, что, по нашему мнению, отражает влияние ганг­лиина на процессы ме­та­болической активности нейтрофи­лов и макрофагов. В группе сравнения показатели НСТ-индуц были снижены в 1 сутки как по сравнению с контрольной, так и основ­ной группами. Но значения ФР остались в норме, так как снизился и НСТ-спонт. В по­следующем (3 и 10 сутки) зафиксирована тен­ден­ция к снижению уровня ФР за счет снижения НСТ-индуц, и со­хранения НСТ-спонт прак­тически на том же уровне. В результате показатели ФР в группе сравнения к 10 суткам стали статисти­чески значимо ниже, чем в основной группе (0,9±0,02 против 1,35±0,06, р<0,001) и кон­троле (0,9±0,02 против 1,23±0,1, р<0,001).

При многих заболеваниях наблюдается активация перекисного окисле­ния липидов, в том числе и при ОБ (, 2000; Пере­тя­гин С. П., 2001).

Сравнительное исследование продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови экспе­риментальных животных с ОБ, получавших и не получавших иммуно­тропную тера­пию, и животных контрольной группы показало суще­ственное на­растание как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ в 1 су­тки после на­несения ожоговой травмы в крови жи­вотных обеих эксперимен­тальных групп. Однако, в основной группе (получавших ганглиин), зафиксировано статистиче­ски значимое увеличение уровня дие­новых конъюгатов (р<0,001) и триенкето­нов (р<0,001), тогда как в группе сравнения ста­тистически значимо увеличи­лось содержание только первичных продуктов ПОЛ (р<0,001)(рис. 3 и 4).

В динамике экспериментальной ОБ в основной группе содержа­ние первич­ных про­дуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови снижалось (1,53±0,21 отн. ед. против 1,96±0,16 отн. ед., р>0,05) и было стати­стически значимо ниже, чем в группе сравнения (2,24±0,25 отн. ед.; р<0,05), а вторичных продуктов ПОЛ, напро­тив, увеличива­лось (1,14±0,12 отн. ед. против 0,89±0,02 отн. ед.; р<0,05), пре­вышая уровень в группе жи­вотных, не получавших иммунотропной терапии (р<0,01).

На 10 сутки после ожога в обеих экспериментальных группах зарегист­ри­ровано снижение уровня первичных продуктов ПОЛ. В основной экспери­мен­тальной группе снижалось также и содержание вторичных продуктов ПОЛ, то­гда как в группе сравнения их уровень оставался стабильно высоким и не дос­тигал показателей контрольной группы.

Таким образом, в группе животных, получавших терапию иммуномодуля­тором пеп­тидной природы после ожога, выявлено более быстрое восстановле­ние процессов пере­кисного окисления липидов.

Активация процессов ПОЛ при ожогах может быть не только результа­том усилен­ного образования кислородных радикалов, но и следствием нару­шения функционирования ферментативных механизмов антирадикальной защиты клетки с участием супероксид­дисмутазы и каталазы (, 2003). Опре­деление активности СОД позволяет оце­нить степень за­щиты организма от сво­бодно-радикального окисления (, 2004).

В нашем эксперименте выявлено, что ожоговая травма приводит к измене­нию уровня суперок­сиддисмутазы в эритроцитах экспериментальных живот­ных. В первые су­тки после ожоговой травмы в основной опытной группе заре­гистрировано стати­стически значимое снижение этого фермента (23,53±2,76% против 30,7±3,70% в контроле), тогда как в группе сравнения, напротив, – су­ще­ственное увеличение его количества (45,28±2,67%, р<0,05). На 3 сутки после ожого­вой травмы в обеих группах выявляли вы­сокий и практи­чески равный уровень СОД, с последующим снижением к 10 сут­кам, более выраженном в группе мышей, получавших ганглиин (29,5±3,51% против 38,8±2,6%, р<0,05) (рис. 3 и 4).

Рис. 3. Динамика продуктов ПОЛ и СОД у экспериментальных животных с ожоговой травмой, получавших ганглиин (опытная группа).

%
 
 

Рис. 4. Динамика продуктов ПОЛ и СОД у экспериментальных животных с ОБ (группа сравнения).

Нами сопоставлена динамика показателей ПОЛ и СОД в двух группах экс­перимен­таль­ных животных (рис. 3 и 4). Как представлено на рисунках, у жи­вотных с ОБ (группа сравнения) уже в первые сутки более чем в 2 раза возрас­тало содержание первичных продуктов ПОЛ в липидных экстрактах крови и их уровень сни­жался только к 10 суткам после травмы.

Уровень вторичных продуктов ПОЛ увеличивался в 1 сутки незначи­тельно, их коли­чество статистически значимо повышалось только к 3 суткам, остава­ясь на таком уровне и на 10 сутки. Уровень СОД изменялся аналогично ди­намике первичных продуктов ПОЛ.

У животных основной группы, получивших иммуномодулятор пептидной природы, в 1 сутки после ожога в 1,7 раза возрастал уровень пер­вичных про­дуктов ПОЛ и одновре­менно в 2 раза увеличивалось содержание вторичных продуктов ПОЛ, тогда как количе­ство СОД, напротив, снижалось. На 3 сутки после ожога значительно снижался уровень первичных продуктов ПОЛ, тогда как содержание СОД и вторичных продуктов ПОЛ – возрастало, с последую­щим снижением до уровня контрольных величин к 10 сут­кам по­сле ожога.

Полученные данные подтверждают важную роль активации ПОЛ и окис­лительного стресса в патогенезе ожоговой болезни. Применение имму­номоду­лятора пептидной при­роды не защищает животных от окислительного стресса, но оказывает мо­дулирующее действие уже в раннем периоде после термиче­ской травмы, обеспечивая од­новременное увеличение как первичных так и вто­ричных продуктов ПОЛ. Низкий уровень СОД в этот период, вероятно, связан с ее потреблением и отражает напряжение компенсаторных механиз­мов.

Исследования цитокинов (ИЛ-10 и ИНФγ) в эксперименте позволяют кон­статиро­вать, что ожоговая болезнь приводит к глубокой депрессии Тh1 типа, практически не влияя на уровень медиатора, продуцируемого Тh2 клетками. Применение иммуномодулятора пептидной природы влияет в большей степени на уровень ИЛ-10, обладаю­щего выражен­ными противовос­палительными свой­ствами и усиливающим гуморальный иммунитет. Данные об уровнях иссле­дуемых цитокинов представлены на рис. 5 и 6.

Рис.5.Уровень ИНФγ в сыворотке крови мышей до ожога и в разные периоды ОБ.

Рис.6.Уровень ИЛ-10 в сыворотке крови мышей до ожога и в разные периоды ОБ.

Установлена прямая корреляционная связь между уровнем ИЛ-10 и содержа­нием вторичных продуктов ПОЛ на 1 и 3 сутки эксперимента у мышей основ­ной группы (r =0,56 и 0,64, р<0,05).

Таким образом, экспериментальные исследования позволили на модели ожоговой болезни установить иммуномодулирующий эффект имму­но­модулятора пептид­ной при­роды – ганглиина. Его применение обес­печи­вает усиление выработки ИЛ-10 и, в мень­шей мере, ИФНγ, что в сово­купно­сти уси­ливает фагоцитарную активность лейкоци­тов, уменьшая при этом вы­ражен­ность оксидативного стресса.

Выводы:

1.  Выявлено развитие выраженного системного воспалительного ответа у боль­ных в ранний период ОБ с гиперпродукцией ФНОα, ГМ-КСФ, ИЛ-8, ИЛ-12р70 и существенным усилением шеддинга рас­тво­римого рецептора I типа ФНОα. Дефицит ИФНγ на 10-14 сутки по­сле ожоговой травмы является прогно­стиче­ским предиктором развития гнойно-септиче­ских осложнений и сепсиса.

2.  Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагопри­ят­ного про­гноза у больных ОБ тяжелой степени: низкий уровень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повышение ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

3.  Установлено, что у больных с ожоговой травмой в ранний период суще­ст­венно уве­личивается уровень СРБ и α1-КГП. Увеличение СРБ более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки ОБ является до­полнительным диаг­ностическим призна­ком тяжести со­стояния боль­ного. Степень увели­чения α1-КГП на 1-3 и 10-14 сутки у тяже­лообож­женных в 1,5 раза выше, чем у пациентов средней степени тяжести. Вы­явлен относительно более низкий уровень α1-АТ в крови больных с тя­желой ожоговой травмой на 10-14 и 21 сутки, что говорит в пользу недоста­точной ак­тива­ции за­щитно-приспособи­тельных реакций. Уро­вень СРБ выше 100 г/л на 10-14 су­тки после ожога сопряжен с небла­гоприятным ис­ходом.

4.  На экспериментальной модели ОБ у мышей отмечается де­прес­сия коли­чест­вен­ных показателей фагоцитоза. Ганглиин оказы­вает по­зитивное влия­ние, уве­ли­чивая фагоцитарную активность, фаго­цитар­ное число и фагоци­тарный ре­зерв.

5.  Под­тверждена важная роль активации ПОЛ и окислительного стресса в па­тогенезе ОБ. Применение иммуномодулятора – ганглиина не защи­щает жи­вотных от окис­лительного стресса, но оказывает модулирующее действие уже в раннем периоде после термической травмы, обеспечивая одновремен­ное увеличе­ние как первичных так и вторичных продуктов ПОЛ и более быстрое восстановле­ние процессов ПОЛ. Низкий уровень СОД связан с ее по­требле­нием и отра­жает напряжение ком­пенса­торных механиз­мов.

6.  Ганглиин усиливает выработку противовоспалительного медиатора – ИЛ-10, корре­лирующего с содержанием вторичных продуктов ПОЛ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В МЕДИЦИНСКУЮ НАУКУ И ПРАКТИКУ

Результаты проведенных исследований, рекомендуемые для внедрения:

1. Разработаны дополнительные иммунологические критерии неблагопри­ят­ного прогноза у больных ОБ тяжелой степени: низкий уро­вень ГМ-КСФ (<5 пг/мл) и ИЛ-12р70 (<2 пг/мл) в 1-3 сутки и повыше­ние ИЛ-8 (>300 пг/мл) на 21 сутки после ожоговой травмы.

2. Необходимо проводить мониторирование СРБ. Его уровень более 50 г/л на 10-14 и 21 сутки ОБ является до­полнительным диаг­ностическим признаком тяжести состояния боль­ного. Уро­вень СРБ выше 100 г/л на 10-14 сутки по­сле ожога сопряжен с небла­гоприятным исходом. Динамика изменений α1-АТ при ожоговой бо­лезни средней степени тяже­сти соответствует нормаль­ному течению защитно-приспо­собительных ре­акций, однако, у тяжело­обожженных отмечается его относительный дефицит.

3. Экспериментальные исследования позволили установить иммуномо­дули­рующий эф­фект имму­номодулятора пептидной природы – ганглиина. Его применение обеспечи­вает уси­ление выработки ИЛ-10 и, в меньшей мере, ИФНγ, что в совокупно­сти усили­вает фа­гоцитарную активность лейкоцитов, уменьшая при этом вы­раженность оксида­тивного стресса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.  Оценка состояния иммунного статуса у тяжелообожжен­ных / , ­никова, , ­шеев // Тихоокеан. мед. жур­н№ 1. - С. 53-55.

2.  Тарасов, фаго­цитарной активно­сти нейтрофилов мышей при экспе­ри­ментальной ожо­говой травме / , ­менко, ­горян // Фундаментальные исследования.- 2004. - № 4. - С. 86.

3.  Тарасов, про­цес­сов перекис­ного окисления липи­дов при ожо­го­вой бо­лезни на фоне применения им­муномодулято­ра «тинростим» / ­сов, ­менко // Тюменский мед. журн№ 2. - С. 42-43.

4.  Яре­менко, ожоговой болезни на актив­ность фагоци­тарно-клеточ­ной защиты орга­низма в эксперименте / ­менко, ­сов, ­горян // Актуальные проблемы экс­перимен­тальной, профи­лактической и клини­че­ской ме­дицины: тезисы докл. VI-й Тихоокеан. научн.-практ. конф. сту­дентов и мо­лодых ученых с международ. уча­стием.- Владивосток, 2005. - С. 42.

5.  Тарасов, фаго­цитарного звена иммунитета и ок­сидантной сис­темы ор­ганизма при ожоговой бо­лезни в клинике и эксперименте при коррек­ции имму­номодулятором «тинростим» / А. Е Тарасов, ­менко // Акту­альные про­блемы эксперимен­тальной, профилактической и клини­че­ской меди­цины: тезисы докл. VI-й Тихоокеан. научн.-практ. конф. студен­тов и мо­лодых ученых с международ. уча­стием.- Владивосток, 2005.- С. 38-39.

6.  Тарасов, -кле­точная защита у больных с ожого­вой трав­мой на фоне применения иммуномодулято­ра «тинростим» / , ­менко // Современные наукоемкие техноло­гии№ 7. - С. 58-59.

7.  Тарасов, «Тинро­стима» на уровень фактора некроза опу­холи в крови больных ожоговой болезнью / , , ­менко // XII российский национальный кон­гресс «Человек и ле­карство»: тезисы докл. – М., 2005. - С. 561.

8.  Тарасов, «Тинро­стима» на пере­кисное окисление липидов и антиок­си­дантную сис­тему при ожого­вой болезни в экс­пе­рименте / // Совре­менные наукоемкие техноло­гии.-2005. - № 8. - С. 72.

9.  Тарасов, иммуно­модулятора-Тин­ростима на пере­кисное окис­ле­ние ли­пидов и антиок­сидантную сис­тему в патогенезе ожоговой болезни в экс­пери­менте / , Н. И. Ми­хайлова // Актуальные проблемы экспери­мен­тальной, профилактической и клини­че­ской меди­цины: тезисы докл. VII-й Тихоокеан­. научн.-практ. конф. студентов и мо­лодых ученых с междуна­род. уча­стием. - Владивосток, 2006. - С. 151.

10. Маркелова, в комплексном ле­чении больных с тяже­лой ожого­вой травмой /, , //Вестн. Рос­сийской военно-медицин­ской академии.-2008.-№2(22), при­лож., ч. II.-С.740-741.

11. Францы­ско, остро­фазного ответа у больных с тяже­лыми ожо­гами / ­ско, // Актуальные проблемы экспе­римен­таль­ной, про­филактической и клини­ческой медицины: тезисы докл. IX Тихоокеан. на­учн.-практ. конф. студентов и моло­дых ученых с между­народ. уча­стием. - Владиво­сток, 2008. - С. 73.

12. Магадова, -иммуно­логические нару­шения у хирурги­ческих боль­ных / , В. А. Ла­занович, // Актуальные проблемы эксперимен­тальной, профилактической и клини­ческой меди­цины: тезисы докл. IX Тихо­океан. научн.-практ. конф. студентов и моло­дых ученых с меж­дународ. уча­стием. - Владиво­сток, 2008. - С. 219.

13. Тарасов, зна­чение оценки ци­токинового ста­туса у боль­ных с тяже­лой ожоговой травмой / // Фундаментальные науки и про­гресс клинической медицины: тез. докл. V конференции мо­лодых ученых Рос­сии с меж­дународ. участием. – М., 2008. - С. 216-217.

14. Маркелова, IL-2 и растворимого ре­цептора IL-2 (srIL-2) в сы-во­ротке крови больных в динамике ожого­вой болезни / ­лова, // Российский иммунологический жур­н.- 2008.- Т. 2(11), № 2-3.- С. 180.

15. Тарасов, цитоки­нового профиля у тяжелообожжен­ных боль­ных / , ­никова, ­келова // II Съезд комбустиологов Рос­сии: сб. науч. тр. – М., 2008. – С. 69-70.

16. Дополнительные диагностические критерии тяжести и прогноза течения ожого­вой болезни / , , ­денникова, : метод. рекомендации. – Владивосток, 2009. – 19 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИЛ – интерлейкин

ИФ – индекс Франка

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФН – интерферон

НСТ-тест – тест восстановления нитросинего тетразолия

ОБ – ожоговая болезнь

ПОЛ – перекисное окисление липидов

СОД – супероксиддисмутаза

СРБ – С-реактивный белок

ФНО – фактор некроза опухолей

α1-АТ – α1-антитрипсин

α1-КГП – α1-кислый гликопротеин

Th1 – Т-хелперы первого типа

Th2 – Т-хелперы второго типа