Клинико-патогенетическое значение факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов и антиоксидантной защиты крови при некоторых ревматических заболеваниях (стр. 1 )

На правах рукописи

ИЛЬИН Михаил Витальевич

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ФАКТОРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА, АПОПТОЗА НЕЙТРОФИЛОВ И АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ КРОВИ ПРИ НЕКОТОРЫХ РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ

14.01.22 – ревматология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Ярославль – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук,

профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук

доктор медицинских наук,

профессор

доктор медицинских наук,

профессор

Ведущая организация

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академии им. Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится « 10 » июня 2010 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.119.01 при ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Автореферат разослан «____» ____________________ 2010г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Ревматические заболевания, характеризующиеся иммунно-воспалительным поражением многих органов и тканей, приводят к сокращению продолжительности жизни больных вследствие раннего атеросклероза, артериальной гипертензии и связанных с ними сердечно-сосудистых катастроф (, 2008; , 2008; U. Nussinovitch, 2009; H. Zinger et al., 2009). Эти заболевания требуют применения комплекса лечебно-диагностических и реабилитационных мероприятий, длительного лечения, сопряженного с частыми госпитализациями, а также значительных экономических затрат на содержание членов общества, утративших из-за болезни возможность трудиться (, 2007; и соавт., 2008; , 2009).

Патологические изменения сердца при ревматических заболеваниях многообразны и диагностируются реже, чем встречаются на самом деле ( и соавт., 2009; и соавт., 2009; D. C. Knockaert, 2007; A. Kahan et al., 2009). Развернутая клиническая картина поражения сердца с симптомами хронической сердечной недостаточности, нарушениями ритма и внутрисердечной проводимости, приводящими нередко к внезапной смерти, наблюдается на поздних стадиях, когда лечебные мероприятия малоэффективны и существенно не влияют на прогноз заболевания (P. M. Seferovic et al., 2006; S. E. Gabriel, 2008).

В настоящее время проблема изучения роли системной воспалительной реакции в нарушениях гемоциркуляции, а также формировании эндотелиальной и миокардиальной дисфункции окончательно не решена. Предложена теория прогрессирования сердечной недостаточности, в основе которой лежит представление об иммунной активации и системном воспалении как маркерах высокого кардиоваскулярного риска и неблагоприятного прогноза заболевания ( и соавт., 2007; , , 2008; H. R. Miranda, 2007; A. Blum, 2009). Показано, что нейтрофилы принимают участие в патогенезе ревматических заболеваний и хронической сердечной недостаточности (*****dolph et al., 2007; Z. Jakus et al., 2009).

Приоритетность комплексного подхода в оценке состояния популяции нейтрофилов подтверждается отсутствием целостного представления о взаимосвязи ключевых событий в жизни этих эффекторных клеток, что объясняет трудности определения участия нейтрофилов в различных патологических событиях. Исследование кислородзависимого метаболизма и апоптоза нейтрофилов представляет собой актуальную задачу, так как позволит не только оценить интенсивность воспалительных реакций и их роль в патогенезе сердечно-сосудистых осложнений при системных заболеваниях, но также прогнозировать их течение и исход.

Таким образом, очевидна необходимость изучения механизмов формирования хронической сердечной недостаточности при ревматических заболеваниях. Будучи звеньями одной цепи, эти процессы, в том числе нарушение метаболической активности и апоптоза нейтрофилов, повреждение эндотелийзависимой вазореактивности, дисфункция миокарда, взаимозависимы и взаимообусловлены. Несомненна перспектива терапевтического воздействия на биоцидность и программированную гибель нейтрофильных гранулоцитов, играющих ключевую роль в системном воспалении, повреждении сосудов и сердца.

Цель исследования

Выявить клинико-патогенетические закономерности экспрессии факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями с дисфункцией миокарда и хронической сердечной недостаточностью.

Задачи исследования

1.  Исследовать показатели окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и состояния системы антиоксидантной защиты крови у больных анкилозирующим спондилитом (АС), системной красной волчанкой (СКВ), системной склеродермией (ССД), ревматической болезнью сердца (РБС) и ишемической болезнью сердца (ИБС) в зависимости от пола и возраста, формы, длительности, активности и характера течения заболевания.

2.  Сопоставить изменения показателей функциональной активности, апоптоза нейтрофилов и антиоксидантного потенциала крови при различных ревматических заболеваниях.

3.  Выявить наличие взаимосвязей между показателями кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови при АС, СКВ, ССД и РБС.

4.  Установить клинико-патогенетическое значение изменения экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов у больных ревматическими заболеваниями.

5.  Определить факторы прогнозирования неблагоприятного исхода и повторной госпитализации у больных АС, СКВ, ССД и РБС в течение 12 месяцев после выписки из стационара.

6.  Выявить изменения показателей метаболической активности, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови в зависимости от характера дисфункции миокарда и функционального класса хронической сердечной недостаточности.

7.  Изучить параметры эндотелийзависимой вазореактивности и оценить зависимость функционального состояния эндотелия от факторов биоцидности, апоптоза нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты.

8.  Исследовать влияние терапии с использованием ингибиторов АПФ эналаприла и моэксиприла на показатели окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота, системы антиоксидантной защиты крови и состояние функции эндотелия у больных АС, СКВ, ССД и РБС.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование показателей экспрессии факторов окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови у больных АС, СКВ, ССД и РБС с наличием дисфункции миокарда и предложена концепция развития хронической сердечной недостаточности при ревматических заболеваниях.

Впервые определены общие признаки и различия показателей функциональной активности, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови при ревматических заболеваниях в зависимости от пола и возраста пациентов, формы, длительности, активности и характера течения патологического процесса.

Впервые дана сравнительная характеристика изменения кислородзависимого метаболизма, синтеза оксида азота, экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов и антиоксидантного потенциала крови у больных ревматическими заболеваниями и ишемической болезнью сердца. В отличие от ИБС, ревматические заболевания, осложненные развитием хронической сердечной недостаточности, характеризуются снижением резерва продукции супероксид-аниона, синтеза оксида азота и экспрессии антигена bak на поверхности нейтрофилов.

Впервые установлена клиническая значимость определения уровня экспрессии проапоптозного белка bak нейтрофилами у больных ревматическими заболеваниями, выявлено существование нозологически детерминированной взаимосвязи между уровнем апоптоза нейтрофилов и состоянием кислородзависимого метаболизма нейтрофилов, обнаружена корреляция между уровнем апоптоза нейтрофилов и клинико-лабораторными показателями, характеризующими активность воспалительного процесса.

Впервые определен характер связи между показателями резерва продукции супероксидного анион-радикала и экспрессии проапоптозного антигена bak на поверхности нейтрофилов, обнаружена взаимосвязь между уровнем продукции оксида азота и резервным потенциалом нейтрофильных гранулоцитов у больных ревматическими заболеваниями.

Впервые выявлены различия показателей метаболической активности, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови у больных АС, СКВ и ССД в зависимости от характера нарушения сократительной функции миокарда. Обнаружено, что усиление окислительного стресса нейтрофилов при ревматических заболеваниях сопровождается увеличением функционального класса хронической сердечной недостаточности.

Впервые получены данные о роли окислительного стресса и апоптоза нейтрофилов в механизмах развития ХСН при ревматических заболеваниях, которые обосновывают выбор диагностических лабораторных маркеров и позволяют применять показатели метаболической активности и спонтанного апоптоза нейтрофилов для контроля эффективности проводимого лечения и прогнозирования течения заболевания.

Впервые продемонстрирована возможность применения ингибиторов АПФ эналаприла и моэксиприла для коррекции нарушений эндотелийзависимой вазореактивности, кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и системы антиоксидантной защиты крови у больных ревматическими заболеваниями.

Практическая значимость

Полученные результаты позволяют научно обосновать и рекомендовать к практическому использованию новые подходы к обследованию и лечению больных ревматическими заболеваниями, осложненными кардиоваскулярной патологией, а также дополнить рекомендации по диагностике и динамическому наблюдению в условиях стационара.

Комплексное изучение эндотелийзависимой вазореактивности в сочетании с исследованием показателей метаболической активности нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты крови позволяет оценить нарушения функциональной способности эндотелия и их изменения в процессе динамического наблюдения за больными.

Изучение показателей резервного потенциала нейтрофилов, определяемых с помощью тестов хемилюминесценции, позволяет прогнозировать развитие хронической сердечной недостаточности у больных ревматическими заболеваниями.

Применение методов исследования продукции нейтрофилами активных форм кислорода и оксида азота в дополнение к стандартному обследованию рекомендуется для прогнозирования повторных госпитализаций и неблагоприятного исхода в течение 12 месяцев после выписки из стационара.

Коррекция дисбаланса в системе образования и утилизации активных форм кислорода, наблюдаемая при назначении эналаприла и моэксиприла больным ревматическими заболеваниями, позволяет предполагать, что положительные эффекты ингибиторов АПФ могут быть связаны не только с воздействием на ренин-ангиотензин-альдостероновую систему, но также с влиянием на механизмы биоцидности клеток и активность системы антиоксидантной защиты крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1.  Изменения кислородзависимого метаболизма, апоптоза нейтрофилов и активности системы антиоксидантной защиты крови играют важную роль в развитии ревматических заболеваний и хронической сердечной недостаточности. Общность патогенетических механизмов данных заболеваний связана с увеличением флогогенного потенциала нейтрофилов, гиперпродукцией факторов окислительного стресса с последующим истощением резервных возможностей и снижением уровня апоптоза клеток.

2.  Ревматические заболевания характеризуются снижением уровня продукции оксида азота и уменьшением экспрессии факторов апоптоза нейтрофилов. Различия определяются изменением продукции и резерва образования нейтрофилами активных форм кислорода, а также состоянием системы антиоксидантной защиты крови в зависимости от формы, активности и характера течения заболевания.

3.  Уровень апоптоза нейтрофилов взаимосвязан с интенсивностью окислительного стресса, резервным потенциалом клеток и клинико-лабораторными показателями, характеризующими активность патологического процесса и поражение внутренних органов. Продукция активных форм кислорода, апоптоз нейтрофилов и состояние системы антиоксидантной защиты крови оказывают влияние на сосудодвигательные реакции и состояние эндотелия у больных ревматическими заболеваниями.

4.  Исследование показателей окислительного стресса, апоптоза нейтрофилов, продукции оксида азота и активности системы антиоксидантной защиты крови позволяет прогнозировать характер течения заболевания, а также эффективно оценивать результативность лечения.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Артериальная гипертония: органные поражения и сопутствующие заболевания» (Ярославль, 2004), VII Российском научном форуме «Кардиология 2005» (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения» (Ярославль, 2005), Ежегодной (XIII) научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы кардиологии» (Тюмень, 2006), Всероссийском форуме «Интеллектуальные ресурсы регионов России», VII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и внедрения информационных технологий двойного применения (Ярославль, 2006), Съезде кардиологов и терапевтов Центрального федерального округа РФ «Актуальные вопросы современной аритмологии» (Рязань, 2006), Всероссийском форуме «Интеллектуальные ресурсы регионов России», VIII Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы разработки и внедрения информационных технологий двойного применения (Ярославль, 2007), XLIX Ежегодной научно-практической конференции Ярославской областной клинической больницы (Ярославль, 2007), III Всероссийской конференции «Социальные аспекты ревматических заболеваний: боль - междисциплинарная проблема» (Смоленск, 2007), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Некоронарогенные заболевания сердца: диагностика, лечение, профилактика» (Санкт-Петербург, 2008), Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 27 работ, в том числе 10 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ для публикации материалов исследований, представляемых на соискание ученой степени доктора медицинских наук.

Внедрение в практику

Методы исследования показателей кислородзависимого метаболизма, продукции оксида азота, спонтанного апоптоза нейтрофилов, системы антиоксидантной защиты крови, эндотелийзависимой вазореактивности внедрены в работу отделений ревматологии и кардиологии Ярославской областной клинической больницы, Межкафедральной иммунологической лаборатории Ярославской государственной медицинской академии, что позволило усовершенствовать и расширить методы диагностики ревматических заболеваний, осложненных кардиоваскулярной патологией. Исследование параметров апоптоза нейтрофилов применяется для оценки эффективности проводимого лечения в стационаре и прогнозирования течения заболевания на амбулаторном этапе. Результаты работы включены в лекционный материал и программу практических занятий для интернов, ординаторов и слушателей кафедры терапии факультета последипломного образования Ярославской государственной медицинской академии.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 332 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 72 таблицами и 55 рисунками. Библиографический указатель содержит 448 источников, в том числе 135 отечественных и 313 иностранных.

Работа выполнена на кафедрах терапии факультета последипломного образования (зав. кафедрой – Заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор ) и микробиологии c вирусологией и иммунологией (зав. кафедрой – Почетный работник высшего профессионального образования РФ, доктор медицинских наук, профессор ) Ярославской государственной медицинской академии (ректор – Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор ), на базе экстренной лаборатории, ревматологического, кардиологического отделений и отделения функциональной диагностики Ярославской областной клинической больницы (главный врач – Заслуженный врач РФ, кандидат медицинских наук ).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

Клиническая характеристика больных

Обследованы 265 больных, в том числе 77 больных анкилозирующим спондилитом, 50 больных системной красной волчанкой, 32 пациента с системной склеродермией, 81 пациент с хронической ревматической болезнью сердца и 25 больных ишемической болезнью сердца, включенных в группу сравнения. Контрольную группу составили 25 относительно здоровых доноров, из них 14 мужчин и 11 женщин, в возрасте от 19 до 54 лет (в среднем 35,1±10,6 лет).

Распределение пациентов по нозологическим формам, полу, возрасту и длительности заболевания представлено в таблице 1.

Таблица 1

Распределение больных по нозологическим формам, полу, возрасту и длительности заболевания

Нозологическая форма	Число пациентов	Возраст, годы	Длительность заболевания, годы	Пол
Мужчины абс. (%)	Женщины абс. (%)
АС	77	41,2±8,1	10,1±4,6	63 (81,8)	14 (18,2)
СКВ	50	39,9±11,3	8,2±7,4	0 (0)	50 (100)
ССД	32	45,5±16,2	8,6±5,2	4 (12,5)	28 (87,5)
РБС	81	55,1±9,6	30,9±15,6	37 (45,7)	44 (54,3)
ИБС	25	58,8±9,01	9,8±8,23	17 (68,0)	8 (32,0)

Диссертационная работа прошла этическую экспертизу. До начала исследования пациенты были осведомлены о его цели, задачах и подписали информированное согласие. Распределение больных по группам осуществлялось методом репрезентативного (от фр. подбора по характеру течения, длительности, активности и тяжести течения заболевания, возрастному и половому признакам, а также наличию хронической сердечной недостаточности.

Критерии включения в исследуемые группы:

1.  Верифицированный диагноз ревматического заболевания и ИБС.

2.  Величина индекса массы тела, не превышающая 34,9 кг/м2.

3.  Отсутствие хронической почечной недостаточности.

4.  Отсутствие противопоказаний для назначения применявшихся препаратов.

Критерии исключения:

1.  Острое нарушение мозгового кровообращения и/или острый инфаркт миокарда в течение предыдущих 12 месяцев.

2.  Наличие сахарного диабета, бронхиальной астмы, заболеваний печени и желудочно-кишечного тракта в стадии обострения.

3.  Наличие острого инфекционного заболевания, аллергических реакций, онкологической патологии, болезней миокарда, злоупотребление алкоголем.

Конечными точками исследования являлись общая летальность, смертность от сердечно-сосудистых причин, частота госпитализаций по поводу ухудшения течения основного заболевания и развития осложнений, включая декомпенсацию хронической сердечной недостаточности и увеличение функционального класса ХСН в течение 12 месяцев после рандомизации.

В зависимости от нозологии на госпитальном этапе назначалась стабильная терапия, соответствующая современным рекомендациям по лечению данного заболевания. Дополнительно к стабильной терапии в течение 3 недель у больных СКВ и ССД применялся моэксиприл, больные АС и РБС получали дополнительно эналаприл. Стартовая доза эналаприла составляла 5 мг/сут., препарат назначался два раза в день. Дозу препарата увеличивали до 20 мг/сут. под контролем уровня артериального давления. Моэксиприл рекомендовался в стартовой дозе 7,5 мг/сут. В зависимости от динамики АД доза препарата увеличивалась до 15 мг/сут.

Диагноз АС устанавливался на основании модифицированных Нью-Йоркских критериев (1984) и классификационных критериев Европейской группы по изучению спондилоартритов (1991). Учитывались варианты начала, характер течения и форма заболевания, стадия сакроилиита, наличие системных проявлений. Оценка активности осуществлялась с использованием валидированной русскоязычной версии вопросника BASDAI и интегрального показателя активности (2007).

Центральной формой АС страдали,8%) человек, периферическая форма выявлена в 8 (10,4%) случаях, ризомелическая форма диагностирована у 6 (7,8%) больных. Минимальная степень активности заболевания зарегистрирована у,6%) пациентов, умеренная – в,4%) случаях. По результатам рентгенологического исследования большинство пациентов –,0%) – имело признаки II стадии сакроилиита, I стадия была выявлена у 3 (3,9%) и III – у,1%) больных. Системные проявления заболевания наблюдались у,3%) пациентов.

Диастолическая дисфункция миокарда была выявлена у,5%) больных, в 7 (9,1%) случаях наблюдалась систолическая дисфункция миокарда, у,4%) пациентов функция миокарда была сохранена. ФК I ХСН определен в,3%) и ФК II ХСН в,3%) случаях.

Диагноз СКВ устанавливали на основании классификационных критериев Американской ассоциации ревматологов (E. Tan, 1982). Для характеристики вариантов течения по критерию активности заболевания использовали классификацию (1972). Определяли индексы активности SLAM (M. Liang et al., 1988) и SLEDAI (C. Bombardier et al., 1992). Антифосфолипидный синдром диагностировали на основании модифицированных критериев D. Alarcon-Segovia и соавт. (1989) и J. Piette (1996).

Течение заболевания имело подострый характер у%) больных. Хроническое течение отмечено в%) случаях. Среди клинико-иммунологических вариантов СКВ в пожилом возрасте развилась у 6 (12%) больных, подострая кожная красная волчанка – в 9 (18%) случаях, антифосфолипидный синдром диагностирован у 7 (14%) пациенток. Активность патологического процесса соответствовала I –%), II –%) и III – 3 (6%) степени. Развитие заболевания сопровождалось: появлением конституциональных симптомов -%), возникновением поражения кожи -%), суставов -%), легких - 4 (8%), почек -%), нервной системы %) случаев.

Нарушение функции миокарда выявлено у%) больных. Преимущественно наблюдалась диастолическая дисфункция с сохраненной систолической функцией миокарда –%) пациентка. Систолическая дисфункция, ассоциированная со снижением фракции выброса левого желудочка, отмечена в 8 (16%) случаях. Функциональные нарушения, сопровождавшиеся развитием ХСН: ФК I – у%), ФК II – у 7 (14%), ФК III – у 6 (12%) и ФК IV – у 2 (4%) пациенток.

Для диагностики ССД использовали критерии Американской ревматологической ассоциации (1980). Определение вариантов течения и стадии развития ССД основывалось на классификации (1993). Диффузная форма заболевания выявлена в,5%), лимитированная – в,5%) случаях. Течение заболевания носило преимущественно хронический характер,2%) и соответствовало II стадии патологического процесса.

Систолическая дисфункция миокарда наблюдалась у 5 (15,6%) больных ССД, диастолическая дисфункция выявлена в%) случаях. Снижение сократительной способности миокарда сопровождалось развитием хронической сердечной недостаточности ФК I - у 9 (28,1%), ФК II - у 7 (21,9%), ФК III - у 5 (15,6%) больных.

Верификация диагноза РБС осуществлялась на основании анамнестических данных, указывающих на наличие перенесенной ранее острой ревматической лихорадки, диагностированной на основании критериев Киселя-Джонса, пересмотренных Американской ассоциацией кардиологов (1992) и модифицированных Ассоциацией ревматологов России (2003).

Наблюдались преимущественно комбинированные пороки сердца. В зависимости от преобладания порока были выделены группы больных с митральным стенозом –,7%), митральной недостаточностью –,8%), аортальным стенозом –,1%) и аортальной недостаточностью –,5%).

Снижение систолической функции отмечено в,3%) случаях. Диастолическая дисфункция с сохраненной систолической функцией миокарда была выявлена у 6 (7,4%) больных. В большинстве случаев дисфункция миокарда носила систолодиастолический характер –,4%). У 8 (9,88%) пациентов сократительная способность миокарда была сохранена. Выявлено,2%) больных, имеющих ФК I ХСН,,2%) пациентов с ФК II,,6%) – с ФК III и%) – с ФК IV ХСН.

Хирургическому лечению были подвергнуты,4%) пациентов. Митральная комиссуротомия была выполнена,1%) и протезирование клапана/ клапанов,3%) больным. Летальный исход зарегистрирован в 6 (7,41%) случаях. Причиной смерти у всех больных стала сердечно-сосудистая патология.

Диагноз ИБС подтверждался на основании характерных симптомов заболевания, сопровождающегося возникновением типичных ангинозных приступов, данных анамнеза, в том числе перенесенного острого инфаркта миокарда, результатов клинического, лабораторного и инструментального обследования, свидетельствующих о наличии признаков хронического ишемического повреждения миокарда.

Систолодиастолическая дисфункция миокарда наблюдалось у%) больного. Снижение диастолической функции обнаружено в 4 (16%) случаях. ФК I ХСН выявлен у 7 (28%) больных, ФК II – у%), ФК III – у 4 (16%) и ФК IV – у 4 (16%) пациентов.

Методы исследования

Для достижения цели и решения поставленных задач, наряду с общепринятыми клиническими, лабораторными и инструментальными методами, использовались специальные иммунологические, иммуноцитохимические, функциональные (эргометрические) и психологические методы исследования.

Исследование функциональной активности нейтрофилов

Выделение нейтрофилов периферической крови проводили на двойном градиенте плотности фиколла-урографина. Функциональную активность нейтрофилов исследовали хемилюминесцентным методом ( и соавт., 1988). Для усиления хемилюминесценции (ХЛ) использовали люминол, индуцирующий хемилюминесценцию пероксида водорода, супероксидного радикала, гидроксил-аниона, аниона гипохлорной кислоты и нитроксильного радикала, или люцигенин, являющийся селективным индикатором супероксид-аниона, (, , 1994).

О функциональном резерве клеток судили по коэффициентам активации хемилюминесценции (КА ХЛлл и КА ХЛлн), которые рассчитывали как отношение индуцированного показателя (иХЛлл и иХЛлн) к спонтанному (сХЛлл и сХЛлн). В качестве индуктора кислородзависимого метаболизма нейтрофилов использовали 1´109 взвесь убитых нагреванием клеток S. aureus штамма p-209.

Оценка состояния системы антиоксидантной защиты крови

О потенциале системы антиоксидантной защиты крови (САОЗ) судили по результатам хемилюминесценции, индуцированной пероксидом водорода (, , 1994). С этой целью к 0,5 мл крови добавляли 1,0 мл Н2О2. Скорость спада хемилюминесценции рассчитывали как отношение разницы максимума интенсивности ХЛ и интенсивности ее свечения через 4 минуты после инициации к максимуму интенсивности, выражая в процентах, что характеризовало антиоксидантный потенциал крови (ХЛ индекс, ХЛи).

Определение продукции оксида азота нейтрофилами

Количественное определение суммарного содержания метаболитов оксида азота (NO3/NO2) в среде инкубации нейтрофилов проводили с помощью реактива Грисса ( и соавт., 2003). Для анализа продукции оксида азота нейтрофильными гранулоцитами 150 мкл культуральной среды, полученной после 6-ти часового культивирования клеток, переносили в пробирку, измеряли оптическую плотность полученных растворов.

Исследование апоптоза нейтрофилов

Для определения уровня экспрессии проапоптозного белка семейства Bcl-2 bak нейтрофилами в процессе спонтанного апоптоза использовали стрептавидин-биотиновый метод. Применяли bak-специфические поликлональные кроличьи антитела («DAKOCytomation», Дания). В качестве положительного контроля использовали моноклональные мышиные антитела к гранулоцит-ассоциированному антигену CD15, отрицательный контроль – разводящая жидкость для антител. Подсчет проводили, определяя абсолютное число и процент положительно окрашенных клеток (bak-положительные нейтрофилы, %).

Определение циркулирующих иммунных комплексов

Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом преципитации сывороточных белков раствором полиэтиленгликоля при рН 8,4 (В. Гашкова и соавт., 1979). Использовали 3,5% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в боратном буфере. Оптическую плотность разведения исследуемой сыворотки в растворе полиэтиленгликоля измеряли против ее разведения в боратном буфере при длине волны 450 нм.

Исследование эндотелийзависимой вазореактивности

Эндотелийзависимая функция эндотелия изучалась с помощью холодовой пробы (, 2001). Исследование проводилось на ультразвуковом аппарате «SONOS 100 CF» («Hewlett-Packard Corporation», США), использовался линейный датчик 5-7,5 MHz. Объектом исследования являлась сонная артерия (*****benfire et al., 2002). Холодовая проба проводилась по стандартной методике (P. Singh, 1991). Рассчитывался показатель напряжения сдвига на эндотелии (τ, Н/м2), а также показатель изменения напряжения сдвига на эндотелии (dτ, %). Для оценки чувствительности эндотелия сонной артерии к напряжению сдвига (К, Ед) был использован модифицированный метод (, 1998).

Функциональные методы исследования

Показатели внутрисердечной гемодинамики оценивались ультразвуковым методом с помощью системы компьютерной сонографии «SONOS 100 CF» («Hewlett-Packard Corporation», США) по стандартной методике, рекомендованной Американской ассоциацией эхокардиографии (1987). Структурно-морфометрические показатели изучались по методу L. Teichholtz (1976). Исследовалось состояние клапанного аппарата, верифицировался характер порока сердца. Систолическая функция левых отделов сердца оценивалась с использованием показателей конечного систолического объема, ударного объема, фракции выброса левого желудочка. Диастолическая функция левого желудочка исследовалась путем регистрации трансмитрального допплеровского кровотока. Рассчитывалась максимальная скорость потока раннего диастолического наполнения (Ve) и максимальная скорость наполнения левого желудочка в предсердную систолу (Va), определялся коэффициент скоростей (Ve/Va). Оценивалось время изоволюмического расслабления, время замедления раннего диастолического наполнения левого желудочка.