Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединий на основе бактерий родов comamonas и pseudomonas - деструкторов (стр. 2 )

Чистые культуры не обладают таким недостатком, и потому являются более приемлемыми для разработок сенсоров; в качестве примеров можно привести модели сенсоров на основе дрожжей Trichosporon cutaneum, обладающих низкой избирательностью и высокой дыхательной активностью, рабочим диапазоном концентраций от 3 до 60 мг/л и относительной ошибкой 6%., на основе которого был создан коммерческий анализатор БПК [123]. Предложен сенсор для определения БПК с использованием клеток T. cutaneum, иммобилизованных в поливиниловый спирт и позволяющий производить измерение БПК с очень коротким временем ответа (менее 30 с), рабочей стабильностью 48 дней и нижним пределом детекции 4 мг/л БПК [102]. С использованием T. cutaneum, иммобилизованных на пористой ацетилцеллюлозной мембране, и кислородного электрода Кларка создан также сенсор для детекции БПК с временем анализа (до восстановления сенсора) 10 мин и нижним пределом детекции 5 мг/ л. Мешающим веществом являлась ксилоза, присутствие которой приводило к снижению величины сигнала, по всей видимости, ввиду медленного разложения этого соединения [107]. Использовался T. cutaneum и при создании сенсора для анализа крахмалосодержащих сточных вод. Сенсор был стабилен более двух месяцев при хранении и месяц в рабочих условиях [124]. Разработан портативный микробный сенсор для определения БПК на основе клеток дрожжей T. cutaneum, непосредственно иммобилизованных на поверхности кислородного электрода Кларка. Время ответа составляло мин. при 20о С, динамический диапазон от 0 до 16 мг/ л БПК и нижний предел детекции 0.2 мг/ л БПК при использовании стандартного глюкозо-глютаматного раствора БПК. Время жизни сенсора составило 8 дней, в рабочих условиях 8 часов [125]. Предложены сенсоры на основе дрожжевых и бактериальных клеток с линейным диапазоном концентраций мг/л БПК [126].

В качестве рецепторных элементов сенсоров для определения БПК использовались также Hansenula anomala, Pseudomonas A4,Clostridium butyricum и B. subtilis [127]. Сенсор на основе кислородного электрода и клеток дрожжей для определения БПК5 обладал нижним пределом детекции 3 мг/л БПК [111]. Предложены сенсоры на основе смешанных культур с использованием комбинации двух микроорганизмов с различным спектром субстратов, Rhodococcus erythropolis и Issatchenkia orientalis с коротким временем анализа (2 мин) [121], на основе смешанной культуры Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis 7B с временем жизни более 2 месяцев [128]. Датчики соединяли избирательность обоих штаммов и их способность усваивать широкий спектр субстратов. Результаты, полученные с БПК-сенсорами при анализе сточных вод, коррелировали с результатами классического метода.

Для оценки БПК изготовлен также микробный сенсор на основе Serratia marcescens LSV-4 и кислородного электрода. Сенсор был нечувствителен к рН в диапазоне В незабуференном растворе ионы Cu2+, Ag+, Cd2+, Zn2+ вызывали существенное уменьшение амплитуды отклика БПК-сенсора [129]. Разработан [130] микробный сенсор на основе бактерий Bacillus licheniformis 7B, устойчивый к таким тяжелым металлам как Fe2+, Fe3+, Cd2+, Hg2+, Cr2+, Pb2+, Sn2+, Al3+, Mn2+ (в концентрации 4×10-3 М). Сенсор для определения БПК предложен на основе устойчивого к присутствию тяжелых металлов штамма Alcaligenes eutrophus KTO-2, выделенного из почвы завода по переработке сточных вод с временем ответа 80 с, воспроизводимостью 2%, скоростью анализа 8 образцов в час и оперативным временем жизни более 30 дней. Сенсорный элемент был устойчив и позволял производить измерения в присутствии ионов Ni2+, Co2+, Zn2+, Cd2+ [131].

Одноразовый амперометрический микробный сенсор был разработан для определения БПК при нитрификации (N - БПК) на основе нитрифицирующих бактерий. Время ответа при измерении N - БПК стандартных растворов аммония и образцов сточной воды составляло минут [132].

Корреляция между величиной БПК, полученной сенсорным методом и методом БПК5 при анализе сточных вод, позволяет сделать следующие выводы [102]:

1). После калибровки величина БПК, полученная сенсором, отражает истинный объем органических соединений в водном растворе,

2). Различный состав сточных вод не оказывает влияния на результаты измерения сенсора,

3). Для различных сточных вод определенного типа расхождение величин БПК, полученных сенсорным методом и методом БПК5, находится в определенном диапазоне,

4). Сенсорные измерения являются адекватным методом для контроля быстрых биотехнологических процессов.

Одной из нерешенных проблем БПК - сенсора является повреждение микробных клеток веществами, содержащимися в сточных водах. Электроды, содержащие отравленные микроорганизмы, показывают более низкое, чем в действительности, БПК и поэтому непригодны для работы. В этих случаях необходима тщательная калибровка сенсора с помощью стандартных растворов [127].

2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов

Вещества, обладающие мутагенным эффектом, также образуются в процессе производственной деятельности человека. Проблема их определения в объектах окружающей среды также актуальна. К настоящему времени описан ряд моделей микробных сенсоров для детекции мутагенов [111]. Показана перспективность использования для этих целей биосенсоров с интегральным ответом [133]. Подобные методы являются более быстрыми, селективными и дешевыми, чем тесты с использованием животных. Так, предварительный скрининг на мутагены был произведен с помощью системы, содержащей два микробных сенсора, на основе рекомбинантного штамма Bacillus subtilis или Salmonella typhimurium (REC-) и дикого штамма (REC+), соответственно. Измерение было основано на разнице в способности к репарации поврежденной ДНК у дикого и рекомбинантного штамма и, соответственно, способности их к выживанию. Чувствительность этой сенсорной системы была в 3 - 6 раз выше, чем у общепринятых методов (минимальная детектируемая концентрация мутагена AF - 2 составляла 1 ´ 10-6 мг/ см3) [127]. Сенсор для определения трихлорэтилена предложен на основе Nitrosoma [134]. Для предварительного скрининга мутагенов с использованием теста на фаговую индукцию использовался лизогенный штамм Escherichia coli GYS027 и нелизогенный штамм GYS026 в комбинации с кислородным электродом. Введение в среду мутагена, такого как AF - 2 и MNNG приводило к фаговой индукции лизогенного штамма пропорционально концентрации мутагенов и ингибированию дыхания только лизогенного штамма, иммобилизованного на электроде. [135, 127].

Бактериальная система биодетекции позволяла производить определение генотоксинов в окружающей среде с временем регистрации порядка 1 мин. Этот клеточный детектор основан на ответе сенсора с SOS-системой в качестве рецептора, чувствительного к повреждению ДНК и биолюминесцентной системы в качестве оптического сигнала. Для ММС получен нижний предел детекции М. [136]. Аналогичная система с использованием SOS-lux теста была предложена для оценки острой токсичности полициклических ароматических углеводородов, в частности, фенантрена и бензапирена [137] с использованием Rhizobium biovar trifolii TAI luxAB [115].

Амперометрический биосенсор для определения ингибиторов нитрификации по потреблению кислорода был разработан на основе смешанной нитрифицирующей культуры [138]. Был сконструирован биосенсор для детекции ряда биологически активных тяжелых металлов. Наличие в клетках промоторов luxcDABE-reporter системы обусловливало биолюминесцентный или флюоресцентный сигнал в ответ на присутствие в среде тяжелых металлов. [139].

Описан сенсор на основе Rhodococcus sp.Р1, обладающий высокой избирательностью по отношению к фенолу и хлорфенолам, которая была достигнута инкубированием его с соответствующим субстратом [121]. Rhodococcus также был использован в сенсоре для определения фенолов и хлорфенолов с линейной зависимостью между уровнем кривой и концентрацией фенола, 2 -, 3 -, и 4 - хлорфенола до 20×10-3 М. В работе использовался кислородный электрод с платиновым катодом [140]. Предел детекции для всех исследованных субстратов составлял 4×10-6 М. Сенсор оставался стабильным 21 день. Недостатком сенсора является довольно низкая селективность [140]. Сенсор, содержащий в составе рецептора клетки P. putida 87, может быть использован для быстрого измерения концентрации монохлорароматических соединений. Этот сенсор был более чувствителен к бензоату и 3-хлорбензоату, чем к 2 - и 4 - хлор, 2, 4- дихлорбензоату и 2, 4 - дихлорфенолу. Интересен относительно высокий сигнал на 3 - хлорфенол и отсутствие сигнала при вводе фенола. Нижние пределы детекции для этих веществ составляют 1×10-8 – 1×10-4 М [121]. Для определения монохлор - и дихлорфенолов разработан биосенсор, содержащий штамм T. cutaneum. Характерными особенностями сенсора являлись отсутствие реакции на бензоат и высокая избирательность к 4 - хлор, 3 - хлор, 2, 4 - и 2, 5 - дихлорфенолам. Сигналы на моно - и дихлорированные фенолы были выше, чем на нехлорированный фенол. Нижний предел детекции для всех изученных субстратов составлял 0.2×10-3 М [121].

Сенсор для определения фенола на основе клеток Pseudomonas putida позволял измерение с нижним пределом детекции 2×10-9 М, что сопоставимо с чувствительностью ферментных сенсоров. При этом линейная зависимость наблюдалась в диапазоне концентраций 1 - 10×10-9 М. Время ответа сенсора с момента введения субстрата составляло 1 мин. При хранении сенсор сохранял активность более месяца [141]. Предложен [142] амперометрический биосенсор для определения концентрации фенола, бензойной кислоты и их монохлорированных производных на основе штамма Pseudomonas putida DSM648. Предел детекции составил 0.1×10-6 М, линейный диапазон детекции составил до 6×10-5 М. При хранении сенсор был стабилен более 21 суток.

Разработаны сенсоры на основе P. fluorescenc и Sphingomonas sp. и кислородного электрода Кларка для селективной детекции нафталина. Для обоих сенсоров нижний предел детекции составил 7,8×10-8 М, что ниже ПДК в подземных водах в Нидерландах (5,4×10-7 М). Линейный диапазон детекции составил 7,8×10-8 – 2,3×10-5 М, время ответа сенсоров составило 2 мин, скорость анализа достигала 6 образцов в час. Рабочее время жизни сенсоров составило 20 дней. [143].

Сенсор для определения бензола в водных средах на основе кислородного электрода и бактерии Pseudomonas putida ML - 2 позволял производить измерения с линейным диапазоном детекции до 1.35×10-3 М, верхним пределом 3.55×10-3 М и временем одного измерения мин. [144].

Сконструировано [145] два сенсора для определения салицилата на основе Pseudomonas cepacia, иммобилизованных в кальций-альгинатный гель. В первом сенсоре в качестве преобразователя был использован кислородный электрод, во втором - проточный калориметр. Чувствительность системы на основе проточного калориметра была в 100 раз выше, чем системы на основе кислородного электрода (5×10-6 М и 0.2×10-3 М соответственно). Сенсор показал высокую чувствительность к салицилату и бензойной кислоте. При высоких концентрациях фенола и салицилата наблюдалось субстратное ингибирование. Линейная зависимость ответов сенсора на концентрации салицилата в модели с кислородным электродом наблюдалась до концентрации 3×10-3 М [145].

Разработан [146] оптический биосенсор на основе генетически созданной биолюминесцентной катаболической бактерии P. fluorescens HK44, несущей гены катаболизма нафталина и салицилата. Сенсор работал в протоке при скоростях мл/ мин, время определения составило: для 12×10-3 М нафталина мин, для 0.12×10-3 М нафталина 24 мин, для 3,×10-5М салицилата мин.

2.2.2.2.3.Сенсоры для определения анионных поверхностно-активных веществ (ПАВ)

В состав бытовых сточных вод входят анионные ПАВ, в частности алкилбензолсульфонаты (LAS), характеризующиеся низкой биодеградабельностью. При попадании в окружающую среду ПАВ оказывают неблагоприятное действие на гидробионтов, снижают качество воды, способствуют растворению органических соединений [20]. Высокие концентрации анионных ПАВ могут изменить состав экосистем в активном иле, используемом на заводах по переработке сточных вод. Контроль содержания ПАВ в природных и сточных водах имеет большое значение с целью недопущения их негативного влияния на окружающую среду. Для экспресс-определения ПАВ может быть применима биосенсорная детекция.

Описан амперометрический биосенсор реакторного типа для мониторинга концентрации анионных ПАВ на основе LAS - деградирующих бактерий. Указанный датчик был успешно испытан на образцах речной воды. Падение сигнала было линейно пропорционально концентрации LAS до 6 мг/ л. Время одиночного анализа составляло 30 мин [20].

Биосенсор для детекции п-толуолсульфоната на основе бактерии C. testos­teroni BS1310 (pBS1010) [147] позволяет измерение целевого вещества с нижним пределом детекции 5 мкМ.

2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического материала в рецепторном элементе сенсора

Для достижения оптимального режима функционирования биосенсора необходимо взаимодействие между катализатором и преобразующим элементом. Для этих целей применяется метод иммобилизации биомассы в рецепторном элементе [121, 127, 148-151], благодаря которому достигается:

- увеличение стабильности биосенсора,

- многоразовое использование биорецептора,

- использование меньшего количества биомассы по сравнению с вариантом, когда суспензия клеток вводится в измерительный раствор перед измерением (т. н. биотопливный элемент),

- возможность хранения рецепторного элемента, что создает предпосылки для промышленного производства анализатора.

Метод иммобилизации возник при разработке биотехнологий непрерывного длительного действия, требующих максимального концентрирования биокатализатора в единице объема, максимальной защищенности от внешних факторов и максимальной энергоемкости [148].

Иммобилизация не должна оказывать неблагоприятного влияния на используемые организмы и быть оптимальной с точки зрения стабильности биорецептора, особенно в случае экологического мониторинга in situ. Применяются физические (адсорбция, включение в гели) и химические (ковалентное связывание с носителями) методы иммобилизации. Однако было показано, что при использовании химических методов происходит снижение активности иммобилизованных клеток [11]. Наиболее простым и широко используемым физическим методом является центрифугирование или фильтрование микробной суспензии через фильтровальную бумагу, ацетилцеллюлозную или нейлоновую мембрану.

Широко применяется иммобилизация микроорганизмов путем включения в гелевые мембраны, такие как агар, желатина, коллаген, полиакриламид, поливиниловый спирт [121]. Включение микробных клеток в большинстве случаев обеспечивает более высокую рабочую стабильность и период хранения по сравнению с клетками, адсорбированными на фильтрах. Преимуществом такого метода является проницаемость гелей для субстрата и кислорода и невозможность вымывания микроорганизмов. В частности, показано позитивное влияние иммобилизации в агаровый гель на интенсивность и полноту биодеградации ароматических соединений [148]. В то же время гелевые мембраны замедляют ответ сенсора. Применяются также полимерные носители [127]. В газовых сенсорах используются также пленки МоО3 [149], титанилфталоцианиновые пленки [150]. Показано, что низкомолекулярные ненасыщенные модификаторы клеток в определенных условиях полностью инактивируют внутриклеточную активность микроорганизмов, в то время как полимерные реакционноспособные носители взаимодействуют с клетками, не затрагивая их внутриклеточных элементов [151].

2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование в разработке биосенсоров для детекции токсичных соединений

Как было отмечено выше, значительное количество микробных биосенсоров разрабатывалось для нужд экологического мониторинга, в частности, детекции токсичных соединений. Амперометрический метод представляет собой определение количества кислорода, потребленного микроорганизмом для деструкции вещества. Поэтому целесообразно производить поиск микроорганизмов, пригодных в качестве основы рецепторного элемента сенсоров такого типа, среди микроорганизмов-деструкторов соответствующих токсичных соединений.

2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений

Микроорганизмы, обладающие способностью разрушать токсичны соединения, широко представлены в природных экосистемах. Так, из осадочных отложений Нью-Йоркской гавани выделено несколько видов бактерий, разлагающих диизопропиламиноэтиловый эфир метилфосфорной кислоты [4], а из вод Черного моря - бактерий, способных к деструкции фенола и резорцина [152]. Почвенная бактерия Rhodococcus erythropolis способна к деградации 2, 4 - динитрофенола [153, 154], 2 - хлор, 4, 6 - динитрофенола [154], пикриновой кислоты [155]. Почвенный штамм Corynebacterium species ПНК-2 осуществляет деструкцию повышенных (до 750 мг/ л) концентраций 2, 4-динитрофенола, а также фенола, бензойной кислоты и ее производных [156]. Возбудитель белой гнили базидиомицет Phanerochaete chrysosporium способен к биодеградации изомеров толуола, этилбензола и ксилола [157]. Из морской воды выделен штамм Comamonas testosteroni, деградирующий поли-3-гидроксибутират в качестве единственного источника углерода для роста [158].

29 бактериальных штаммов - деструкторов сульфоароматических соединений выделены из активного ила и идентифицированы до вида. Большинство из них (23 вида) идентифицированы как C. testosteroni, 4 - как Pseudomonas putida, 2 - Pseudomonas stutzeri. Штаммы C. testosteroni деградировали бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, 2-нафталинсульфонат, п-сульфобензоат, 5-сульфосалицилат, P. putida - бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, и п-сульфанилат, P. stutzeri - бензолсульфонат и п-толуолсульфонат. Все штаммы - деструкторы способны усваивать данные соединения, как в качестве единственного источника углерода, так и в качестве единственного источника серы [159, 160].

Phanerochaete chrysosporium был способен к деградации всех сульфонированных азопроизводных [161]. В работе [162] описан совместный рост Hydrogenophaga palleroni и Agrobacterium radiobacter на 4-аминобензолсульфонате. Hydrogenophaga palleroni дезаминирует 4-ABS, продуктами разложения которого питается Agrobacterium radiobacter [162]. Из ила рек были выделены штаммы Pseudomonas, способные деградировать аминобензолсульфонаты с выделением сульфита по мета-пути с помощью катехол-2,3-диоксигеназы. При этом наиболее активно деградировались п-толуолсульфонат и бензолсульфонат [163]. Cladosporium resinae (CMI88968) деградировал 1-фенилдодекан-п-сульфонат и 1-фенилундекан-п-сульфонат [164]. Бактерии из рода Pseudomonas были способны утилизировать нафталин, антрацен, стирол, этилбензол, 1-фенилэтанол, 2-фенилэтанол, ацетофенон, фенилуксусную кислоту, бензол [165], хлорбензол, толуол, о-ксилол, нафталин, бензиловый спирт [166], фенол [167]. Водоросль Ochromonas danica (993/ 28) метаболизировала фенол, все изомеры крезола и 3, 4 - ксилола из инкубационной среды [168]. P.putida [] разлагал смесь толуола и п-ксилола. Из загрязненных фенолом почв и активного ила выделены штаммы Pseudomonas sp.и Bacillus sp., способные к деструкции фенола в концентрации 250 – 500 мг/ л [170]. Показано [171], что микроорганизмы ризосферы более активно разлагают фенол, чем почвенные микроорганизмы.

Есть данные об утилизации некоторых арилсульфонатов бактериальными штаммами Alcaligenes sp. [172], Bacillus sp [173], Moraxella sp. [174], ассоциациями бактерий Hydrogenophaga polleroni и Agrobacterium radiobacter [175], а также грибами Cladosporium resinae [176], Phanerochaete chrysosporium и Streptomyces chromofuscus [177]. Phanerochaete chrysosporium [178] был способен к деградации тринитротолуола и тринитрамина. Накоплена информация о путях разложения сульфоароматических соединений [179], выделены и охарактеризованы некоторые ключевые ферменты [180]. Однако все еще отсутствует целостное представление о роли микроорганизмов в разложении данного класса соединений. Неизвестно, насколько распространена способность к деструкции арилсульфонатов среди микроорганизмов природных сообществ [159].

Бактерии родов Pseudomonas [181-183] и Comamonas способы к деградации арилсульфонатов, причем бактерии рода Comamonas представлены шире и отличаются большим разнообразием деградативных активностей. Показана способность штамма C. testosteroni разлагать п-толуолсульфонат (в проточной системе в реакторе на биопленках с перемешиванием среды максимальная скорость распада вещества составила 198 мг/С л ч [184]). 23 штамма C. testosteroni были способны к деструкции бензолсульфоната, п-толуолсульфоната, 2-нафталинсульфоната, п-сульфобензоата, 5-сульфосалицилата [185, 186]. Выделены ферменты пути расщепления сульфоароматических соединений [186-188]. Исследованы также гены, кодирующие эти ферменты [189, 190]. Штаммы - деструкторы 3-аминобензолсульфоната и 4-аминобензолсульфоната идентифицированы как C. acidovorans [134]. Выделен штамм C. acidovorans 191, использующий п-толуолсульфонат в качестве источника серы, но не в качестве источника углерода и энергии [191].

Бактериальные штаммы - деструкторы ароматических сульфонатов присутствовали в различных образцах активного ила из очистных сооружений химических предприятий и городов, географически удаленных друг от друга. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что способность к деструкции сульфоароматических соединений преимущественно распространена среди членов микробных популяций активного ила аэрируемых очистных сооружений, что можно объяснить присутствием данного класса органических соединений в сточных водах. Среди изолированных и идентифицированных бактериальных штаммов, способных использовать арилсульфонаты в качестве единственного источника углерода, серы и энергии, бактерии вида C. testosteroni составили подавляющее большинство (почти 80%). Штаммы - деструкторы, принадлежащие к этому виду, присутствовали во всех образцах активного ила [159].

Ароматические углеводороды, галогенированные и сульфонированные ароматические и алифатические соединения широко используются в производстве ПАВов, красителей, химической, упаковочной и древесной промышленности [191]. Показана целесообразность использования вышеуказанной технологии с использованием биомембран в сочетании с отбором специфически приспособленных микробных сообществ, для разрушения ксенобиотиков. Рассматривается способность к биодеградации п-толуолсульфоновой кислоты двумя бактериальными штаммами в суспензии и в иммобилизованных культурах [192].

Микроорганизмы с широкой субстратной специфичностью обладали очевидным преимуществом для обработки смешанных стоков. Присутствие других источников углерода (интермедиатов и продуктов деградации) способствует развитию микроорганизмов, разрушающих нецелевые соединения. Высокое содержание неспецифических бактерий ведет к понижению степени разложения целевого соединения, хотя общая минерализация органического углерода при этом может возрасти [192].

2.3.2. Методы направленной модификации микроорганизмов для придания им деструктивных свойств

В свете последних достижений в области микробиологии и биотехнологии помимо поиска появилась возможность конструирования новых штаммов микроорганизмов, способных к более эффективной деградации органических загрязнителей до менее токсичных продуктов, вплоть до углекислого газа и воды [4]. Наиболее токсичны для окружающей среды соединения, имеющие тенденции к накоплению, такие как дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), альдрин, полихлорбифенилы, 2, 4 - Д; 2, 4, 5 - Т [152]. Хлорированные фенолы и их производные, которые используются в качестве гербицидов, фунгицидов и общих биоцидов, также являются токсичными ксенобиотиками. Большое количество фенолов образуется в процессе хозяйственной деятельности человека [142].

Для уничтожения ксенобиотиков в окружающей среде выгоднее использовать не отдельные микроорганизмы, а микробные сообщества, поскольку в результате действия группы микроорганизмов токсичные продукты одних штаммов могут усваиваться другими штаммами [122].

В разработке специализированных штаммов для разложения ксенобиотиков применяются два подхода:

1. Разработка чистой культуры, способной разлагать специфические компоненты.

2. Разработка культуры неизвестного состава, характеризующейся способностью к разрушению целевых компонентов [192]. Скрининг делает возможным выделение бактерий, разрушающих ксенобиотики, из почв, активированных илов или других систем, загрязненных специфическими соединениями.

Применение высокоэффективных деградирующих штаммов может быть осуществлено в следующих областях:

1). Генная инженерия in vivo, когда некоторые специфические генетические элементы вводятся в плазмиды для придания микробным штаммам возможности изменения генетического материала и создания новых сочетаний генов, а также для расширения спектра разлагаемых субстратов [193].

2). Мутагенез и отбор. При этом проводится работа по выделению микроорганизмов из природных источников и придания им (в случае необходимости) требуемых качеств путем мутаций.

2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации

В начале 1970-х гг появились первые публикации об открытии у бактерий плазмид биодеградации (D - плазмид), определяющих способность бактерий разлагать устойчивые в условиях окружающей среды органические соединения, такие как толуол и ксилолы, нафталин, бифенил или хлорароматические компоненты, 3 - хлорбензоат и 2, 4 - дихлорфеноксиуксусная кислота. Количество и разнообразие плазмид биодеградации постоянно растет [194]. Конъюгативность плазмид биодеградации обеспечивает возможность конструирования новых активных биодеградантов с повышенной экспрессией полезных функций.

Примером может служить штамм В13, который не способен к деградации салицилата и хлорсалицилатов. При перенесении плазмиды из штамма NAH7, в которой, кроме других, находится ген, кодирующий салицилатгидролазу, получили трансконъюгант, способный разлагать 3, 4, и 5 - хлорсалицилаты [191].

Перспективным может быть поиск микроорганизмов, способных к деградации целевых соединений, с помощью биосенсорной методики [195]. В частности, с помощью такого метода был отобран ряд микроорганизмов, способных к деградации хлорфенолов, хлорбензоатов, 2, 4 - D, дибензофуранов и их интермедиатов.

2.4. Потребности в детекции ароматических и сульфоароматических соединений

2.4.1. Ароматические соединения и их влияние на экосистемы

Ароматические соединения и их производные, используемые в различных отраслях промышленности, а также как биоциды в сельском хозяйстве, относятся к ксенобиотикам. Они характеризуются токсичностью и сравнительно устойчивы к микробной деградации ввиду относительно высокой энергии разрыва ароматического кольца, что делает нежелательным их попадание в окружающую среду. Существуют различные микроорганизмы, способные к деградации ароматических и галоароматических соединений [196-198]. В природе фенолы образуются в процессах гумусообразования [141], чем и обусловлено наличие фенолдеградирующих микроорганизмов в почвенных сообществах. Микробная деградация фенола тщательно изучена. Показано, что основным промежуточным продуктом окисления фенола является катехол. Катехол в дальнейшем метаболизируется по орто - или мета - путям для образования соединений, необходимых для жизнедеятельности клетки [141]. Ключевые реакции процесса деградации фенола включают усвоение кислорода.

2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических соединений

Сульфокислоты принадлежат к числу наиболее сильных органических кислот. Они представляют собой кристаллические вещества, легко растворимые в воде и часто гигроскопичные, вследствие чего их обычно выделяют в виде солей. Многие ароматические сульфокислоты и их соли являются важными промежуточными продуктами в промышленном органическом синтезе [199] и широко применяются в химической промышленности. П-толуолсульфокислота (ТС) используется при производстве крезола, дезинфицирующих лекарственных веществ, ядохимикатов, ПАВ, полимеров, что ведет к ее появлению в стоках химических предприятий. ТС является нормируемым в воде соединением: ПДК п-толуолсульфокислоты - 1.0 мг/л, ПДК ее натриевой соли - 0.05 мг/л. В 1990 году было произведено 2 млн. тонн линейных алкилбензолсульфонатов, 86000 тонн аминосульфонатов и 289000 тонн алкилсульфатов [12].

Существующие аналитические методы определения сульфокислот рассматриваются в книге [200]. Эти методы подразделяются на три основные группы: химические, физические и инструментальные.

Химические методы включают в себя:

а) Реакцию с основаниями,

б) Пиролиз с элиминированием SO2,

в) Этерификацию с диазометаном.

Из физических методов применяются УФ - и ИК - спектрометрия, а также следующие хроматографические методы:

а) Колоночная хроматография,

б) Бумажная хроматография,

в) Тонкослойная хроматография,

г) ВЭЖХ.

Для качественного определения сульфокислот используется образование солей с ароматическими аминами, лучше всего с анилином, о - или п - толуидином или с хлоридом бензилизотиурония [199].

2.4.3. Возможный механизм биодеградации толуолсульфоната (TС)

Для штамма C. testosteroni BS1310 показано [159] наличие пути катаболизма TС, заключающегося в первоначальном десульфонировании и последующем окислении 4- метилкатехола по мета - пути. Первые две реакции данного пути идут с участием диоксигеназ с потреблением кислорода.

Ранее участие ферментов мета - окисления катехола в деградации бензолсульфоната (БС) продемонстрирована Ripin et al.[159] для штамма C. testosteroni H - 8. Однако деструкция TС бактериями этого вида, описанная Locher et al. [180] для штамма C. testosteroni T - 2, протекала путем мета - окисления образующегося протокатехата. Деструкция TС через мета - окисление 4 - метилкатехола описана для бактериальных штаммов - деструкторов, в том числе Cain & Farr [182] для флюоресцирующих псевдомонад, а также Bird & Cain [159] для штамма Alcaligenes sp. Данные также говорят в пользу участия катехол - 2, 3 - диоксигеназы в утилизации штаммом C. testosteroni BS1310 как БС, так и TС [159].

2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni

Штамм C. testosteroni - грамотрицательная аэробная палочка, описанная ранее (Locher et al., 1989; Thurnheer et al., 1986) и образующая на агаре круглые (мм), прозрачные однообразные колонии [191]. Штамм, выделенный из активного ила завода по переработке сточных вод Vidy (Lausanne, Switzerland), был определен и назван C. testosteroni L - 1 [192]. Штамм C. testosteroni T - 2 был получен из института микробиологии (ETH Zurich, Switzerland). Оба штамма высевались на селективной (сульфоароматические соединения в качестве источника углерода) и неселективной (содержащей агар PCA) среде [192]. C. testosteroni L - 1 был более устойчив к низким значениям рН, вплоть до 5. Применялись два одинаковых стационарных колоночных реактора с биомембранами из нейлоновых волокон, имеющих рабочий объем 66 мл. Было показано, что C. testosteroni T - 2 был более эффективен в усвоении целевого вещества и общего органического углерода, чем L - 1 [192].

C. testosteroni T - 2 разрушал п-толуолсульфонат через окисление метиловой группы до п-сульфобензоата и затем до клеточного материала, СО2 и сульфата. C. testosteroni L - 1 разрушал ТС, который составлял почти 100% общего органического углерода, имеющегося в культурах, быстрее и без регистрируемых сульфонированных промежуточных соединений [192]. Разнообразие микроорганизмов в колонке, засеянной C. testosteroni T - 2 было в 2 - 3 раза меньшим, чем с C. testosteroni L - 1. Это можно объяснить выработкой п-сульфобензоата C. testosteroni [192].

Механизм биодеградации ТС рассматривался в гл. 2.4.3.

Штамм C. testosteroni при выращивании на богатой среде терял способность усваивать TС в качестве единственного источника углеродного питания, а также в качестве единственного источника серы. Данные варианты были обозначены C. testosteroni BS1320. Это позволило сделать предположение, что способность усваивать TС в штамме C. testosteroni BS1310 детерминируется плазмидами. Для его проверки были проведены выделение и визуализация плазмидной ДНК. Выявлено наличие одной плазмиды размером около 130 тпн. Данная плазмида была обозначена pBS1010. Анализ вариантов штамма C. testosteroni BS1310, потерявших способность расти на TС, показал отсутствие в них плазмиды pBS1010. Для подтверждения участия плазмиды pBS1010 в катаболизме TС и проверке ее конъюгативности был проведен опыт по конъюгационному переносу данной плазмиды. Частота конъюгационного переноса плазмиды из штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) в реципиентные штаммы C. testosteroni BS1330 и C. testosteroni BS1322 равнялась 5.6 ´ 10-6 и 2.1 ´ 10-8 соответственно [194]. Таким образом, плазмида pBS1010 сообщала бактериальным клеткам способность утилизировать данное соединение, как в качестве единственного источника углерода, так и в качестве единственного источника серы [159]. Для трансконъюгантного и плазмидного штамма характерна высокая активность катехол -2, 3 - диоксигеназы. Бесплазмидный штамм демонстрировал отсутствие данной активности, что подтверждает участие катехол -2, 3 - диоксигеназы в деструкции TС, а также доказывает локализацию гена данного фермента на плазмиде pBS1010. Плазмида способна к конъюгационному переносу между штаммами C. testosteroni [159]. Потребление кислорода, происходящее при деградации TС, позволяет рассматривать бактерии C. testosteroni BS1310 (pBS1010) в качестве потенциального рецепторного элемента биосенсора с амперометрическим типом регистрации. C. testosteroni T - 2 деградирует ТС через п-сульфобензоат (PSB) [159]. Известны все ферментные белки пути расщепления ТС C. testosteroni T - 2 и структура оперона (последовательность tsaMBCD). Идентичные ферменты п-сульфобензоат (PSB) - диоксигеназных систем (psbAC) и терфталат (TER) - диоксигеназных систем (TerZabR) были обнаружены в двух независимо выделенных штаммах C. testosteroni, Т - 2 и PSB - 4 [201].

Штамм C. testosteroni BS1310, использованный в настоящей работе, выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО "Новомосковскбытхим" г. Новомосковск Тульской области как деструктор бензолсульфоновой (БС) и п-толуолсульфоновой (TС) кислот [159].

В заключение по обзору литературы можно отметить, что имеются определенные преимущества при использовании биосенсоров на основе микробных клеток для экологического мониторинга. К ним относятся простота изготовления, надежность, более высокая рабочая стабильность, относительная дешевизна получения биоматериала. Актуальна проблема детекции сульфоароматических соединений, широко представленных в промышленных и бытовых сточных водах. В то же время в литературе отсутствуют данные по разработке биосенсоров для детекции сульфоароматических соединений на основе микроорганизмов, и описано относительно малое их количество для детекции фенола. Данное обстоятельство являлось определяющим при выборе цели исследования.