Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединий на основе бактерий родов comamonas и pseudomonas - деструкторов (стр. 3 )

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Исследование способности микроорганизмов к деградации толуолсульфоната (ТС)

В работе использован бактериальный штамм Comamonas testosteroni BS1310, содержащий плазмиду катаболизма бензолсульфоната и ТС (pBS1010), размером 130 тпн. C. testosteroni – почвенный микроорганизм, грамотрицательная палочка. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО “Новомосковскбытхим”, г. Новомосковск Тульской области, и предоставлен для исследования лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. РАН. Культуру выращивали на минеральной среде E с ТС в качестве единственного источника углерода и энергии. В работе использовали п-толуолсульфонат натрия (TС) (Aldrich, USA, 95%), бактоагар (“TypUSA”, FERAK, Berlin (West)).

Полученные клетки отделяли центрифугированием, после чего промывали калий-фосфатным буфером. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2%-ный агаровый гель при температуре 45оС. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками гранулировали, продавливая через сито с размером ячеек 500 мкм. Гранулы агара с иммобилизованными клетками промывали буфером декантацией 3 – 5 раз в цилиндре объемом 250 мл, отбирая 1-минутную фракцию.

Трансформация TС иммобилизованными и свободными клетками изучалась в периодических условиях на качалке (200 об/ мин) при температуре 26оС. В колбы Эрленмейера объемом 750 мл помещали 80 мл буфера, содержащего 109 мг клеток (по сухому весу) и TС в конечной концентрации 1.25 мМ. Субстрат вносили в виде водного раствора. Из реакционной смеси через определенные промежутки времени отбирали аликвоты водной фазы, в которых определяли содержание TС.

3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками. Процесс осуществляли свободными отмытыми клетками в колбах Эрленмейера объемом 750 мл, содержащих 100 мл буфера. ТС вносили в виде водного раствора в конечной концентрации 1.25 мМ. Концентрация (по массе сухих клеток) в реакционной среде составляла 0.4 мг/мл. Для контроля динамики процесса через определенные промежутки времени из реакционной среды отбирали пробы объемом 2 мл. Концентрацию ТС измеряли после удаления клеток центрифугированием в течение 15мин при 5000 g. Концентрацию ТС определяли двумя способами: спектрофотометрически, измеряя ОП261, или обращенно-фазовой жидкостной хроматографией высокого давления, измеряя оптическую плотность ОП254. Значение скорости деградации рассчитывали по максимальному наклону касательной к квазилинейному участку рабочей кинетической кривой. Скорость деградации выражали в единицах удельной активности (нмоль • мин - 1• мг-1 клеток (сухой вес)).

3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками. Трансформацию ТС клетками, включенными в агаровый гель, осуществляли в условиях, аналогичных для свободных клеток.

3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток.

Ферментативную активность свободных и иммобилизованных клеток оценивали по наклону линейного участка кинетических кривых в условных единицах активности, отнесенных к 1 г носителя или 1 мг клеток (мкМ мин-1 мг-1 или мкМ мин-1 г –1 носителя).

3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях.

Процесс осуществляли иммобилизованными клетками в стеклянной термостатированной колонке (реактор идеального вытеснения). Рабочий объем колонки составлял 5.7 мл, диаметр 1.7 см, высота колонки 2.5 см, концентрация клеток - 5 мг/мл геля. Скорость подачи раствора в колонку варьировали от 72 до 353 мл/ч, что соответствовало удельной скорости от 12 до 62 ч -1. Степень трансформации субстрата, выраженная в процентах от исходной концентрации, и производительность колонки (нмоль•мин-1•мг-1•клеток (по сухому весу)) оценивали, измеряя концентрацию ТС в элюате.

3.1.5. Контроль процесса деградации.

Концентрацию TС определяли двумя способами: спектрофотометрически при 261 нм на спектрофотометре (Shimadzu UV-160 A, Япония) и методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления на колонке длиной 15 см, заполненной сепаролом SGXC, C18, 7 мкМ фирмы "Tessek LTD" (Чехия). Анализ осуществляли с использованием насоса HPP 5000 и UV – детектора LCD 2563 фирмы "Laboratorne Pristroje" (Чехия) при 254 нм. Подвижная фаза состояла из фосфатного буфера (рН 6.7) и метанола (85:15). Скорость протока составляла 1.5 мл/мин.

Потребление кислорода свободными клетками измеряли на полярографе LP – 7 (ЧССР) с помощью закрытого тефлоновой пленкой платинового электрода Кларка. Начальную концентрацию кислорода в среде принимали равной 250 мкМ. В качестве среды дыхания использовали калий-фосфатный буфер, рН 7.4. Температура измерения 22 – 25оС. Конечный объем пробы – 2 мл.

В работе использовали п-толуолсульфонат натрия ("Aldrich", США). Все остальные реактивы имели квалификацию "х. ч." ("Реахим", РФ).

3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта штамма C. testosteroni.

Элиминирование плазмиды осуществляли с целью изучения ее роли в метаболизме штамма путем обработки штамма митомицином согласно методике [202]. Полученный штамм, не содержащий плазмиды, был обозначен как C. testosteroni BS1320.

C. testosteroni BS1310 (pBS1010) выращивали в колбах Эрленмейера вместимостью 500 мл (объем среды 200 мл) на качалке (100 об/мин) при 27°С на жидкой синтетической среде М9 с использованием 5 мМ толуолсульфоната в качестве единственного источника углерода и энергии. Культивирование C. testosteroni BS1320 производили с использованием 5 мМ сукцината в качестве единственного источника углерода и энергии; биомассу собирали центрифугированием и ресуспендировали в калий-фосфатном буфере (30 мМ, рН 7.6). Клеточную суспензию, имеющую оптическую плотность 0.4 единицы, использовали для формирования рецепторного элемента биосенсора.

3.2. Разработка микробного сенсора для определения п-толуолсульфоната

3.2.1. Среда культивирования. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду следующего состава (г/л): K2HPO4 ´ 3H2O – 4, NaH2PO4 ´ 2H2O – 0.4, NH4NO3 – 1, MgSO4 ´ 7H2O – 0.4, ZnCl2 – 0.0205, FeCl3 ´ 6H2O – 0.027, MnCl2 ´ 4H2O – 0.01, CuCl2 ´ H2O – 0.00085, Co Cl2 ´ H2O – 0.0024, H3BO3 – 0.0003. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали TС в концентрации 5 мМ. Бактерии выращивали в течение 30 ч в колбах объемом 750 мл, содержащих 200 мл среды, при перемешивании на качалке (200 об/мин) при температуре 27°С. Биомассу определяли весовым методом (105о С).

3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов. Иммобилизацию микроорганизмов производили включением в 2%-ный агаровый гель согласно методике, описанной в монографии. Полученную гелевую мембрану толщиной 0.3-0.5 мм и площадью 20 мм2 фиксировали на измерительной поверхности электрода Кларка (тип Ingold 531-04, США), который использовали в качестве преобразователя биосенсора. Измерения проводили в кювете объемом 5 мл при температуре 20°С и постоянном перемешивании. Измерительной средой являлся 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.6). Измеряемым параметром (ответом сенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала dI/dt, нА/с при введении вещества.

3.2.3. Исследование деградирующей активности микроорганизмов.

Полученные вышеописанным способом клетки отделяли центрифугированием при 5000 g в течение 30 мин., промывали калий-фосфатным буфером (30 мМ, рН 7.6). Указанный буфер использовали и в дальнейшем. Осадок суспендировали в том же буфере и использовали в работе. Клетки иммобилизовали в 2% - ный агаровый гель при температуре 45оС. Полученный блок геля с иммобилизованными клетками фрагментировали через сито с размером ячеек 500 мкм. Концентрация клеток в геле при этом составляла 10 мг (сухой вес) на 1 мл геля. Носитель промывали буферным раствором. Для освобождения от эндогенного дыхания гранулы помещали в колбу с 0.25 мМ TС в буфере и оставляли при перемешивании на качалке (200 об/ мин) в течение 10 ч.

3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола

3.3.1. Объектом исследования являлись бактериальные штаммы, выделенные из почв месторождений нефти Западной Сибири и хранящиеся в коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. РАН. Штаммы выделялись методом накопительных культур с использованием в качестве субстрата нефти и дизельного топлива. Накопительные культуры инкубировали в жидкой среде Эванса, содержащей нефть качестве единственного источника углерода и энергии, в течение 3-5 дней. Разведения высевали на агаризованную среду Е с нефтью. Отдельные колонии, выросшие на нефти, пересевали. Выделено свыше 100 штаммов – деструкторов нефти и нефтепродуктов. Отдельные штаммы проверялись на способность к росту на индивидуальных субстратах – компонентах нефти: нафталине, 2- метил - нафталине, фенантрене, гексадекане, м-крезоле, феноле и ряде других. Двадцать восемь штаммов оказались способны к утилизации фенола.

Для культивирования утилизирующих фенол микроорганизмов использовали минеральную среду Е. Состав среды Эванса следующий (г/л или мл/л): K2HPO4 – 8.71 г, 5 M раствор NH4CI – 1 мл, 0.1 M раствор Na2SO4 – 1 мл, 62 мM раствор MgCI2 – 1 мл, 1 мM раствор CaCI2 – 1мл, 0.005 мM раствор (NH4)6Mo7O24×4H2O, микроэлементы – 1мл (состав микроэлементов в г/л): ZnO – 0.41 г, FeCI3×6 H2O – 5.4 г, MnCI2×4H2O – 2 г, CuCI2×2H2O – 0.17 г, CoCI2×6H2O – 0.48 г, H3BO3 – 0.06 г, (pH 7.0).

Для получения агаризованной среды того же состава в нее добавляли 1.5% агара. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали пары фенола.

3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола. В эксперименте были использованы 8 штаммов грамотрицательных бактерий, отобранные из 28 штаммов, способных к росту на моноциклических ароматических субстратах, в том числе на феноле, и характеризующиеся наибольшей скоростью роста, и 1 штамм-деструктор нафталина (P.putida BS394(p20)). Штаммы были предоставлены для исследований Лабораторией биологии плазмид ИБФМ им. РАН и исходно были выделены из почв нефтяных месторождений Западной Сибири.

Проводилась предварительная идентификация отобранных штаммов. Высев штаммов на среду KingB и дальнейший анализ под UV показал, что все 9 штаммов относятся к флуоресцирующим псевдомонадам. Далее видовую принадлежность штаммов флуоресцирующих псевдомонад определяли на основании ARDRA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) продуктов амплификации гена 16S рРНК с использованием мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции RsaI, MspII и HaeIII. Рестрикционные фрагменты 16S рДНК разделяли электрофоретически в 2%-м агарозном геле. В качестве контрольных штаммов использовали хорошо изученные и охарактеризованные штаммы P. putida mt-2 (Nelson et al., 2002), P. fluorescens 2-79 (Weller, 1983) и P. aeruginosa PAK NP1 (Delaney et al., 2001). Результаты ARDRA показал, что 7 из используемых штаммов принадлежат предположительно к P. putida mt-2 и только один из них А-13 по - видимому, относится к P. fluorescens

Исследовалась способность выбранных штаммов к росту на различных субстратах. Ни один из штаммов не был способен к росту на полициклических ароматических углеводородах. Штаммы росли на бензоате. Штамм А-13 помимо способности к росту на феноле, мог использовать также гексадекан в качестве единственного источника углерода и энергии.

3.3.3. Иммобилизацию клеток проводили методом физической сорбции на хроматографической бумаге, для чего 10 мкл клеточной суспензии наносили на бумагу (5´5 мм2) и высушивали в течение 20 мин. Сформированный таким образом рецепторный элемент фиксировали на рабочей поверхности кислородного электрода Кларка. Измеряемым параметром являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала (dI/dt, нА/c). Измерения проводили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при 20оС и постоянном перемешивании раствора.

3.3.4. Хранение бактериальных штаммов осуществляли в микроаэрофильных условиях при 4°С в полужидкой богатой среде под вазелиновым маслом. В качестве богатой среды для выращивания бактерий использовали среду LB следующего состава (г/л): триптон – 10, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 10. Микроорганизмы выращивали при 27°C.

3.3.5. Скорость окисления субстрата бактериальными клетками определяли полярографически. Измеряемым параметром являлось изменение максимальной скорости выходного сигнала (dI/dT, нА/c). В качестве преобразователя использовали амперометрическую систему Ingold 531-04 (USA). Измерения производили в кювете открытого типа емкостью 5 мл при температуре 20оС и постоянном перемешивании раствора. В качестве измерительной среды использовали 30 мМ калий-фосфатный буфер (рН 7.6).

Бактериальные клетки выращивали до начала стационарной фазы роста на агаризованной среде указанного выше состава. После образования сплошного газона (1-2 суток) клетки смывали 30 мМ калий-фосфатным буфером (рН 7.6), осаждали центрифугированием на центрифуге Eppendorf (тип 5413, UK), в течение 3 мин при 15000 g и промывали буфером того же состава.

3.4. Характеристика полярографической измерительной системы

В исследованиях для регистрации интенсивности окислительного метаболизма бактериальных клеток применяли преобразователи амперометрического типа, характеризующиеся следующим набором параметров: диапазон рабочих токов при содержании кислорода в измеряемой среде, содержащей 9 мг О2/л, составлял 60 нА, величина темнового тока не превышала 2% от тока в среде, содержащей 9 мг О2/л, периодичность измерения составляла 5-7 проб в час, операционная стабильность - не менее 10 сут, аналитическая чувствительность (максимальная скорость изменения сигнала при вводе пробы) - не ниже 0.5 ´ 10-3, погрешность измерения составила не более 3%, мощность – 30 Вт, рабочая температура - 20оС.

Использовался кюветный и проточно-инжекционный типы измерения с диапазоном скоростей протока в пределах от 0.1 до 5 мл/мин. Исследования интенсивности окислительного метаболизма бактериальных клеток, а также процессов окисления органических субстратов в присутствии искусственных акцепторов электронов, выполнялись с использованием специализированных гальванопотенциостатов, обеспечивающих регистрацию тока в диапазоне от ± 0.1 нА до ± 10 мА.

3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с иммобилизованным активным илом установки биохимочистки стоков (БХО)

3.5.1. Отбор проб активного ила проводился из аэротенков БХО, после 30 мин отстаивания он использовался для эксперимента. Время отстаивания 30 мин было выбрано, поскольку именно такое время отстаивания принято в стандартной методике определения илового индекса [203].

Иловый индекс отобранных проб ила составлял от 70 до 100, что соответствует требованиям технологического регламента работы установки БХО.

3.5.2. Иммобилизацию активного ила проводили путем физической сорбции на активированном угле с размерами гранул l = 1-5 мм, d = 1 мм. Объем иммобилизованного активного ила варьировался в зависимости от объема колонки и составлял от 5 до 15 мл (соотношение ил: уголь составляло 1:5).

3.5.3. Условия эксперимента. Реакционной средой эксперимента являлся входящий сток установки биохимочистки сточных вод. Геометрические размеры колонки составляли: h = 90 мм, d = 30 мм. Использовалось три варианта заполнения колонки с высотой заполнения соответственно 30, 60 и 90 мм. Объем колонки при этом составлял соответственно 21, 42 и 63 мл. Помимо этого варьировалась условия аэрации. Во всех трех случаях использовались варианты колонок без аэрации и с принудительной аэрацией. Для принудительной аэрации использовался воздух КИП (приблизительный расход 5 л/ мин). Кроме того, были исследованы свойства ила, находившегося в отсутствие субстрата с аэрацией 10 суток (ил из минерализатора).

3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки осуществлялся по фенолу. В качестве контроля (холостой пробы) использовалась колонка, заполненная активированным углем без микроорганизмов.

Скорость протока составляла 2 – 5 мин-1.

3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки получены из журналов ежедневного контроля качества стоков в период с 1994 по 2002 год.

3.5.6. Фенол в пробах определяли титриметрически согласно методики [204]. Кислород определяли титриметрически по Винклеру согласно методики [205].

3.6. Оптимизация работы установки БХО

3.6.1. Концентрация растворенного кислорода измерялась прецизионным кислородомером фирмы Hanna Instruments HI 9143.

3.6.2. Замеры проводились по первому и второму коридору каждого аэротенка с интервалом по длине аэротенка 10 м в верхнем слое иловой смеси. Длина коридора составляет 39 м (округленно 40). Точки отбора лежали на продольной оси коридора.

3.7. Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом с использованием t – критерия Стьюдента. Кривые на графиках строились по средним значениям, полученным в результате не менее 5 экспериментов. Анализатор выполнял процедуры определения максимального значения сигнала и процедуру дифференцирования сигнала с погрешностью не выше 0.5 %.

3.8. Основные технические параметры анализатора приведены в таблице № 1

Таблица № 1

Наименование	Значение параметра
Преобразователь электрохимического типа (полярографический электрод), имеющий диапазон рабочих токов при содержании кислорода в измеряемой среде 9 мг/л	50 – 60 нА
Величина темного тока, не более	2% от тока в среде, содержащей 9 мг/л кислорода
Тип измерения	проточно-инжекционный
Объем измеряемой пробы	любой из диапазона 10 – 1000 мкл
Время анализа одиночной пробы, не более	3 мин
Периодичность измерения проб	проб/час
Рабочая температура, °C	20 - 25
Возможность работы в стационарном и переносном вариантах	предусмотрена
Электропитание	220 В переменного тока; предусмотрено питание от источника постоянного тока 12 В
Энергообеспечение	30 Вт
Размеры, см	20×20×15
Масса, кг	не более 3

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Структура исследования

Оптимизация процесса очистки сточных вод на установке биохимической очистки сточных вод

 

В задачи исследования входило на основании анализа литературных данных произвести подбор микроорганизмов-деструкторов сульфоароматических и фенольных соединений. Затем на основе выбранных штаммов сформировать рецепторные элементы сенсоров для детекции целевых веществ. Параллельно провести исследование параметров деградации указанных соединений, как на основе лабораторного штамма, так и с помощью реальных микроорганизмов, входящих в состав биоценоза активного ила. Произвести оценку, и по возможности, оптимизацию функционирования очистных сооружений с помощью биосенсорного подхода.

4.1. Биодеградация TС с помощью C. Testosteroni BS1310(pBS1010)

В работе использовался C. testosteroni BS1310 (pBS1010), использованный нами как биорецептор при формировании сенсора [147] для определения п-толуолсульфоната.

В качестве носителя использовался агар, который является широко приме­няемым в микробиологической практике препаратом. Водные растворы, содержащие % агара, образуют прочные гели, устойчивые в нейтральных растворах. Ранее этот носитель был использован как оптимальный [147] при формировании биосенсора для определения TС на основе C. testosteroni BS1310 (pBS1010).

На рис. 1 представлена динамика трансформации TС свободными и иммобилизованными клетками. Cкорость превращения TС иммобилизованными клетками была несколько ниже, чем свободными. Это, вероятно, может быть обусловлено, диффузионными затруднениями для субстрата в гранулах агарового геля (фактор эффективности составляет 0.8). Потеря активности клеток после иммобилизации может быть обусловлена диффузионными затруднениями для субстрата и/или кислорода в агаровой матрице.

4.1.1. Деградация TС свободными и иммобилизованными клетками в периодических условиях

Изучена кинетика деградации TС иммобилизованными и свободными клетками в периодических условиях при перемешивании. Полученные данные представлены на рис. 1. Следует отметить также, что свободные клетки раньше достигают более глубокой степени деградации по сравнению с иммо­билизованными.

Показано, что трансформация п-толуолсульфоната как свободными, так и иммобилизованными клетками сопряжена с потреблением кислорода. Скорость потребления кислорода составляет 2 моля на 1 моль TС. Это согласуется со схемой трансформации TС до пирувата (мета - путь), показанной ранее для C. testosteroni [159]. Данные представлены в таблице 1.

Таблица № 2. Потребление кислорода свободными и иммобилизованными клетками при деградации п-толуолсульфоната.

КЛЕТКИ	Потребление О2, нмоль мин-1 мг-1.*	Активность, нмоль мин-1 мг-1
В присутствии TS	Без TS
СВОБОДНЫЕ	13.1	1.5	6.5
ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ	8.5	0.9	4.2

Рис. 1. Динамика трансформации TС свободными и иммобилизованными клетками C. testosteroni в периодических условиях.

На кривой 1 показано изменение концентрации TС в течение эксперимента с иммобилизованными клетками. Наиболее активно TС разлагался в первые 8 часов эксперимента. В последующие часы концентрация TС оставалась прак­тически неизменной на уровне 75 мкг/ мл. Это могло произойти вследствие исчерпания TС в среде или вследствие инактивации клеток.

На кривой 2 показана динамика уменьшения концентрации TС в экспери­менте со свободными клетками. Концентрация TС достигла постоянного уровня в 50 мкг/ мл в течение 10 часов. Таким образом, можно видеть, что иммобилизованные клетки разлагают TС более быстро, а свободные – более полно, хотя и за большее время по сравнению с иммобилизованными.

Для исследования ферментативных реакций в клетках в открытых системах наиболее изучен проточный реактор с идеальным вытеснением. Этот тип ре­актора представляет собой объем, равномерно заполненный клетками, в ко­торый с постоянной скоростью подается раствор субстрата. При этом в ста­ционарном состоянии устанавливается постоянный градиент субстрата и продукта реакции, который определяется скоростью протока вводимого субстрата.

4.1.2. Деградация TС в непрерывных условиях

Была изучена деградация TС иммобилизованными клетками C. testosteroni BS1310 в непрерывных условиях на колонке с непрерывной подачей субстрата. На рис. 2 представлены зависимости деградации TС и продуктивности процесса от удельной скорости протока через колонку (биореактор). Следует отметить, что максимумы кривых не связаны друг с другом и максимальная деградация TС соответствует удельной скорости протока/час, в то время как максимальная продуктивность наблюдалась при/час.

При оптимальных условиях реактор работал до 5 суток без потери активно­сти, которая соответствовала 37 мкМ (7.6 мг TС)/мг клеток (с. в.). Вероятно, при низких скоростях протока концентрация кислорода, поступающего с протоком, становится лимитирующим фактором процесса деградации TС. При высоких концентрациях субстрата можно рекомендовать использование каскада из нескольких колонок, связанных друг с другом. На рис. 3 показана схема процесса деградации п-толуолсульфоната по мета-пути.

Таким образом, определены оптимальные условия работы реактора, при которых достигается максимальная активность и производительность системы. В работе [129] также использовался биореактор по разложению п-толуолсуль­фоната С. testosteroni. Объем реактора составлял 8.2 л, количество биомассы 20.8 г, из которых 23% активной. Производительность реактора составила 198 мг C/л´ч. В работе [184] производительность реактора составила 0.4 г/л´час и время непрерывной работы реактора 9 месяцев.

Рис. 2. Степень разложения п-толуолсульфоната и продуктивность иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310(pBS1010) на колонке в зависимости от скорости протока.

Рис. 3. Схема деградации п-толуолсульфоната по мета-пути.

4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (TС)

4.2.1. Скрининг шатммов-деструкторов арилсульфонатов

Поиск штаммов-деструкторов арилсульфонатов представлялось наиболее эффективным произвести среди микроорганизмов, обитающих в активных илах очистных сооружений ввиду присутствия в стоках (как промышленных, так и бытовых) арилсульфонатов.

29 бактериальных штаммов - деструкторов сульфоароматических соединений выделены из активного ила и идентифицированы до вида Балашовым [159]. Большинство из них (23 вида) идентифицированы как C. testosteroni, 4 - как Pseudomonas putida, 2 – P. stutzeri. Штаммы C. testosteroni деградировали бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, 2-нафталинсульфонат, п-сульфобензоат, 5-сульфосалицилат, P. putida - бензолсульфонат, п-толуолсульфонат, и п-сульфанилат, P. stutzeri - бензолсульфонат и п-толуолсульфонат. Все штаммы - деструкторы способны усваивать данные соединения как в качестве единственного источника углерода, так и в качестве единственного источника серы [159]. Аналогичные результаты получены в работе [159], где использовался штамм P. putida S - 313 (DSM6884). Культура успешно десульфонировала компоненты сурфактантов до соответствующих фенолов, которые были идентифицированы при помощи газовой хроматографии и масс-спектрометрии.

4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni

В работе использован бактериальный штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), полученный из коллекции культур Лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. РАН. Штамм выделен из активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений ПО «Новомосковскбытхим» г. Новомосковск Тульской области [159]. Способность штамма к разложению п-толуолсульфоната (далее TС) явилась критерием для его использования при создании биосенсора для детекции TС.

Было показано[159], что способность к биодеградации TС штаммом C. testosteroni детерминирована плазмидой.

4.2.3. Характеристика сенсоров на основе плазмидсодержащего и бес­плазмидного штамма C. testosteroni

На рис. 4 показана калибровочная зависимость биосенсора, построенная для п-толуолсульфоната. Разработанный сенсор характеризовался высокой чувствительностью. Нижний предел детекции (определяемый как концентрация субстрата, ответ на которую вдвое превосходит значение относительной ошибки) составил величину ~5 мкМ. C целью подбора оптимального режима работы сенсора проводили исследование влияния на него различных внешних факторов.

Рис. 4. Калибровочная кривая сенсора на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Исследуемое вещество - п-то­луолсульфонат.

Рис. 5. Зависимость величины ответа микробного сенсора на основе иммобилизованных клеток плазмидсодержащего штамма C. testosteroni BS1310 (pBS1010) от температуры. Концентрация толуолсульфоната - 25 мкМ.