Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединий на основе бактерий родов comamonas и pseudomonas - деструкторов (стр. 4 )

На рис. 5 показано влияние температуры на микробный сенсор. Мак­симальный ответ наблюдали при 35°С; при более высоких значениях температуры величина ответа падала, по-видимому, в связи с обратимой частичной инактивацией ферментных систем бактерий.

Оптимальной областью рН при использовании клеток C. testosteroni в данной модели представляется рН 7.6, что согласуется с рН-оптимумом роста использованного штамма [159].

Изучение зависимости ответов модели от концентрации NaCl (рис.6) показало, что максимальные ответы наблюдались в области 30 мМ раствора NaCl. Отметим, что сенсор на основе C. testosteroni BS1320 (субстрат сенсора - этанол) был менее чувствителен к концентрации солей, чем сенсор на основе исходного штамма (субстрат - п-толуолсульфонат). Возможное объяснение этого факта заключается в ингибировании высокими концентрациями солей систем активного транспорта сульфоароматических соединений. Для проверки этого предположения была получена зависимость ответа сенсора на основе плазмидсодержащего штамма для этанола в концентрации 10 мМ. Вид полученной кривой был сходен с таковым для ионной зависимости штамма C.testosteroni BS1320.

Рис. 6. Зависимость величины ответа сенсора на основе иммобилизо­ванных клеток C. testosteroni от концентрации NaCl. 1 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - п-толуолсульфонат (25 мкМ), 2 - штамм C. testosteroni BS1320, субстрат - этанол (10 мМ), 3 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - этанол (10 мМ). Показатели разброса данных представляют собой стандартное отклонение результатов.

Рис. 7. Зависимость величины ответа микробных сенсоров на основе иммобилизованных клеток C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и элиминанта С. testosteroni BS1320 от концентрации клеток в агаре. 1 - штамм C. testosteroni BS1310 (pBS1010), субстрат - п-толуолсульфонат (25 мкМ), 2 - штамм C. testosteroni BS1320, субстрат - этанол (10 мМ). Показатели разброса данных представляют собой стандартное отклонение результатов.

Зависимость ответов моделей от концентрации клеток в биорецепторном элементе приведена на рис. 7. Для изученного штамма оптимальным объемным соотношением клетки/агар в рецепторе являлось значение 1/10 (30 мг/мл агара). Для бесплазмидного штамма оптимальное соотношение составило 10 мг/мл агара (калибровка по этанолу). Снижение величины ответа при более высоких концентрациях биомассы, по-видимому, объясняется недостатком О2 в области рецепторного элемента вследствие интенсивного фонового дыхания клеток, что подтверждается снижением базового уровня сигнала электрода с иммобилизованными клетками. Более низкая оптимальная концентрация для бесплазмидного штамма объясняется, по-видимому, тем, что на окисление моля ТС потребляется 2 моля О2, а на окисление моля этанола требуется 3 моля О2.

Стабильность сенсора изучали путем введения контрольных концен­траций исследуемого вещества через определенные промежутки времени (4 раза/сут). Ответ сенсора сохранял постоянный уровень в течение двух недель. При хранении геля с включенными клетками C. testosteroni BS1310 при 4°С в течение 24 сут чувствительность рецепторных элементов не изменялась.

Сенсор на основе бактерий C. testosteroni BS1310 (pBS1010) обладал высокой специфичностью к п-толуолсульфонату, бензолсульфонату и катехолу (рис. 8).

Рис. 8. Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного ( ) и бесплазмидного ( ) варианта C. testosteroni. Все субстраты вводили в концентрации 10 мМ:

1 – толуолсульфонат 2 – фенол 3 – салицилат 4 – бензоат 5 – бензолсульфонат 6 – сульфобензоат 7– катехол

8 – алкилбензолсульфонат 9 – арабиноза 10 – арабит 11 – глицерин 12 – этанол 13 – глюкоза 14 – ксилоза

15 - ксилит 16 - метанол 17 - сорбит 18 - цитрат 19 - ацетат 20 - сорбоза 21 – ДДС-Na

Высокая чувствительность сенсора к катехолу объясняется, по-видимому, тем, что это соединение является интермедиатом катаболизма сульфоароматических соединений (см. схему). Следует отметить, что биосенсор на основе бесплазмидного штамма C. testosteroni BS1320 был практически нечувствителен к сульфоароматике, так как не содержал плазмиды pBS1010. Его ответы на катехол и другие ароматические соединения были также невелики, в то время как чувствительность к углеводам, спиртам и органическим кислотам близка к таковой биосенсора на основе C. testosteroni BS1310 (pBS1010). Это обстоятельство позволяет сделать предположение о потенциальной эффективности дифференциальной системы детекции сульфоароматических соединений, включающей сенсоры на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов. Поскольку специфичность большинства микробных сенсоров невысока, представлялось полезным использование дифференциальной измерительной системы на основе двух штаммов, специфичность которых различается по небольшому числу субстратов. В этом случае сигнал на требуемое вещество при анализе сложной смеси определялся бы вычитанием сигналов обоих сенсоров.

Для проверки возможности использования плазмидного и бесплазмидного штамма в составе дифференциальной пары для детекции п-толуолсульфоната было проведено их срав­нительное исследование. На основе полученных данных был произведен расчет эффективности сенсора на основе дифференциальной пары плазмидный – бесплазмидный штамм. Для этого были рассчитаны суммы сигналов, вызываемых нецелевыми веществами, у плазмидного и бесплазмидного варианта штамма.

При выполнении оценок предполагалось, что сигналы сенсора аддитивны, т. е. измерения проводятся в области линейной зависимости сигналов сенсора от концентрации данного соединения. Следует также отметить, что оценка получена для всех соединений, присутствующих в равной концентрации, составляющей 10 мМ.

Рис. 9. Субстратная специфичность сенсоров на основе плазмидного ( ) и бесплазмидного ( ) варианта C. testosteroni. Все субстраты вводили в концентрации 10 мМ:

1 – толуолсульфонат 2 – фенол 3 – салицилат 4 – бензоат 5 – бензолсульфонат 6 – сульфобензоат 7– катехол

8 – алкилбензолсульфонат 9 – арабиноза 10 – арабит 11 – глицерин 12 – этанол 13 – глюкоза 14 – ксилоза

15 - ксилит 16 - метанол 17 - сорбит 18 - цитрат 19 - ацетат 20 - сорбоза 21 – ДДС-Na

Таблица № 3. Анализ субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта C. testosteroni.*

Исследуемое вещество	Величина сигнала сенсора на основе плазмидного штамма	Величина сигнала сенсора на основе бесплазмидного штамма	Разница величин сигналов сенсоров
1 – толуолсульфонат	0.017 18 – цитрат	0.17	0.153
9 – арабиноза	0.006	0.014	0.008
10 – арабит	0	0.085	0.085
11 – глицерин	0.037	0.036	-0.001
12 – этанол	0.049	0.02	-0.029
13 – глюкоза	0.029	0.036	-0.007
14 – ксилоза	0.007	0.0085	0.0015
15 - ксилит	0.009	0.014	0.005
16 - метанол	0.015	0.014	-0.001
17 - сорбит	0.019	0.014	-0.005
18 - цитрат	0.009	0.008	-0.001
19 - ацетат	0.068	0.046	-0.022
20 - сорбоза	0.009	0.0068	-0.0022
Суммарная разница			0.0373
Разница сигналов на целевое вещество			0.153

*Примечание. Данные, представленные в графе "Разница величин сигналов сенсоров" приведена в виде диаграммы на рис. 10.

В таблице показаны результаты анализа сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного штаммов в ответ на введение целевого вещества и мешающих соединений.

Как видно из таблицы, суммарная погрешность сигнала (добавочный сигнал) от присутствия посторонних веществ в пробе составляет 0.0373 нА/с. Разница величин сигналов на целевое вещество (п-толуолсульфонат) составляет 0.153 нА/с. То есть, величина погрешности (дополнительный сигнал) составляет 24% при наличии в среде мешающих веществ всех исследованных классов.

Рис. 10. Разница величин сигналов сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта штамма на п-толуолсульфонат и на мешающие соединения.

Предлагаемый сенсор на основе пары из плазмидного и бесплазмидного варианта можно также использовать для определения общего количества сульфоароматических соединений, поскольку сенсор на основе плазмидного варианта реагировал не только на ТС, но и на другие сульфоароматические соединения. В таблице № 3 дан анализ субстратной специфичности с учетом присутствия в среде нескольких сульфоароматических соединений. Как видно из таблицы, все сульфоароматические соединения вызывали у сенсора на основе плазмидного варианта штамма значительно большие по амплитуде сигналы, чем у сенсора на основе бесплазмидного варианта.

Таблица № 4. Анализ субстратной специфичности сенсоров на основе плазмидного и бесплазмидного варианта C. testosteroni с учетом присутствия в среде измерения нескольких сульфоароматических соединений.

Исследуемое вещество	Величина сигнала сенсора на основе плазмидного штамма	Величина сигнала сенсора на основе бесплазмидного штамма	Разница величин сигналов сенсоров
1 – толуолсульфонат	0.017 18 – цитрат	0.17	0.153
2 – фенол	0.001	0.003	0.002
3 – салицилат	0.008	0.009	0.001
4 – бензоат	0.013	0.006	-0.007
5- бензолсульфонат	0.004	0.16	0.156
6 – сульфобензоат	0.005	0.037	0.032
7 – катехол	0.015	0.143	0.128
8 – алкилбензолсульфонат	0.007	0.019	0.012
9 – арабиноза	0.006	0.014	0.008
10 – арабит	0	0.085	0.085
11 – глицерин	0.037	0.036	-0.001
12 – этанол	0.049	0.02	-0.029
13 – глюкоза	0.029	0.036	-0.007
14 – ксилоза	0.007	0.0085	0.0015
15 – ксилит	0.009	0.014	0.005
16 – метанол	0.015	0.014	-0.001
17 – сорбит	0.019	0.014	-0.005
18 – цитрат	0.009	0.008	-0.001
19 - ацетат	0.068	0.046	-0.022
20 – сорбоза	0.009	0.0068	-0.0022
21- ДДС Na	0	0.009	0.009
Суммарная разница			0.1663
Разница величин сигналов на целевое вещество			0.351

Погрешность (добавочный сигнал) при определении общей суммы сульфоароматических соединений в присутствии всех мешающих веществ составляет 47%; в отсутствие катехола, но в присутствии всех остальных соединений – 11%. Такие результаты были достигнуты благодаря тому, что величины сигналов на некоторые мешающие вещества были выше у плазмидного варианта, а на некоторые – у бесплазмидного. Поэтому сигналы на мешающие вещества в целом несколько уравновешивали друг друга. В связи с этим при использовании сенсора для мониторинга природных и сточных вод следует учитывать их специфику. При преобладающем присутствии в среде измерения сульфоароматических соединений, и наличии остальных соединений в меньших концентрациях, поправка будет очень малой, поскольку величина 11% получена для ситуации, когда все вещества присутствуют в среде в равной концентрации. В реальных сточных водах, как правило, преобладает какая-либо группа соединений, определенная спецификой производства. Поэтому можно предполагать, что при анализе специфических сточных вод, содержащих сульфоароматические соединения (например, сточные воды предприятий по производству ПАВ), величина погрешности измерения будет существенно ниже полученной нами в лабораторных условиях.