Биосенсоры для детекции сульфоароматических и фенольных соединий на основе бактерий родов comamonas и pseudomonas - деструкторов (стр. 1 )

п-толуолсульфоната и фенола

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАСТЕНИЙ РАН

 

На правах рукописи

МАКАРЕНКО АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ СУЛЬФОАРОМАТИЧЕСКИХ И ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДОВ

COMAMONAS И PSEUDOMONAS - ДЕСТРУКТОРОВ

п-ТОЛУОЛСУЛЬФОНАТА И ФЕНОЛА

Специальность: 03.00.23 – биотехнология

Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д. х.н., профессор

САРАТОВ, 2007 год

Список используемых сокращений 6

1. ВВЕДЕНИЕ 7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биосенсоры как направление

в аналитической биотехнологии 13

2.1. Типы преобразователей, используемые в

биосенсорах. Электрохимические преобразователи 14

2.2. Типы биологических материалов, применяемых в

рецепторных элементах биосенсоров 15

2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, антител и

иммунных комплексов, ДНК, животных и

растительных клеток, клеточных органоидов 15

2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток 17

2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых

и водных сред 19

2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы 19

2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы 20

2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью

микробных биосенсоров 21

2.2.2.2.1. Определение БПК 21

2.2.2.2.2. Детекция мутагенов и поллютантов 25

2.2.2.2.3. Сенсоры для определения анионных

поверхностно-активных веществ (ПАВ) 28

2.2.2.3. Методы иммобилизации биологического

материала в рецепторном элементе сенсора 29

2.3. Микроорганизмы-деструкторы и их использование

в разработке биосенсоров для детекции токсичных

соединений 30

2.3.1. Микроорганизмы-деструкторы токсичных соединений 30

2.3.2. Методы направленной модификации

микроорганизмов для придания им деструктивных свойств 34

2.3.3. Плазмидная детерминированность генов биодеградации 35

2.4. Потребности в детекции ароматических и

сульфоароматических соединений 36

2.4.1. Ароматические соединений и их влияние на экосистемы 36

2.4.2. Краткая характеристика сульфоароматических

соединений 36

2.4.3. Возможный механизм биодеградации

толуолсульфоната (ТС) 37

2.5. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 38

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41

3.1. Изучение Исследование способности микроорганизмов

к деградации толуолсульфоната (ТС) 41

3.1.1. Трансформация ТС свободными клетками 41

3.1.2. Деградация ТС иммобилизованными клетками 42

3.1.3. Определение скорости ферментативной реакции клеток 42

3.1.4. Деградация ТС в непрерывных условиях 42

3.1.5. Контроль процесса деградации 43

3.1.6. Получение плазмидного и бесплазмидного варианта

штамма C. testosteroni 43

3.2. Разработка микробного сенсора для определения

п-толуолсульфоната 44

3.2.1. Среда культивирования 44

3.2.2. Иммобилизация микроорганизмов 44

3.2.3. Исследование деградирующей активности

микроорганизмов 44

3.3. Разработка микробного сенсора для детекции фенола 45

3.3.1. Объект исследования 45

3.3.2. Штаммы-деструкторы фенола 46

3.3.3. Иммобилизация клеток 46

3.3.4. Хранение беактериальных штаммов 47

3.3.5. Скорость окисления субстрата

бактериальными клетками 47

3.4. Характеристика полярографической измерительной

системы 48

3.5. Деградация фенола в колоночном реакторе с

иммобилизованным активным илом установки

биохимочистки (БХО) 49

3.5.1. Отбор проб активного ила 49

3.5.2. Иммобилизация активного ила 49

3.5.3. Условия эксперимента 49

3.5.4. Контроль на входе и выходе колонки 49

3.5.5. Данные по работе установки биохимочистки 49

3.5.6. Определение фенола 50

3.6. Оптимизация работы установки БХО 50

3.6.1. Концентрация растворенного кислорода 50

3.6.2. Проведение замеров 50

3.7. Статистическая обработка полученных результатов 50

3.8. Основные технические параметры анализатора 50

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 51

4.1. Биодеградация ТС с помощью

C.testosteroni BS1310(pBS1010) 52

4.1.1. Деградация ТС свободными и иммобилизованными

клетками в периодических условиях 52

4.1.2. Деградация ТС в непрерывных условиях 54

4.2. Сенсор для детекции п-толуолсульфоната (ТС) 57

4.2.1. Скрининг штаммов-деструкторов арилсульфонатов 57

4.2.2. Характеристика штамма Comamonas testosteroni 57

4.2.3. Характеристика сенсоров на основе

плазмидсодержащего и бесплазмидного штамма C. testosteroni 58

4.2.4. Исследование работы сенсора на основе клеток

Comamonas testosteroni в проточной системе 76

4.3. Разработка микробного биосенсора для детекции

фенола 80

4.3.1.Скрининг штаммов-деструкторов фенола 80

4.3.2. Характеристика штамма 32-I

(Субстратная специфичность) 84

4.3.3. Характеристика сенсоров на основе

плазмидсодержащего и бесплазмидного вариантов

штамма 32-I 85

4.4. Возможные пути решения практических задач

с применением биосенсорного подхода 97

4.4.1. Деградация целевых соединений сточных вод

иммобилизованными на колонке микроорганизмами

установки биохимочистки сточных вод (БХО) 100

4.4.2. Использование полученных данных для оценки

эффективности процесса очистки стоков в аэротенках

установки биохимической очистки 106

4.4.2.1. Исходное состояние установки биохимочистки 106

4.4.2.2. Результаты проведенных технических и

технологических мероприятий на сооружениях БХО 111

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116

6. ВЫВОДЫ 118

7. ЛИТЕРАТУРА 120

8. ПРИЛОЖЕНИЕ 144

8.1. Акт внедрения 144

Список используемых сокращений

Вт – ватт

г – грамм

мА – миллиампер

мг – миллиграмм

мин – минута

мкМ – микромоль

мкм – микрометр

мл – миллилитр

мМ – миллимоль

мм – миллиметр

нА – наноампер

нА/с – наноампер в секунду

нМ – наномоль

нм – нанометр

об/мин – оборотов в минуту

ОП – оптическая плотность

см – сантиметр

сут - сутки

тпн – тысяч пар нуклеотидов

ТС - толуолсульфонат

ч – час

1.  ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В условиях современного интенсивного промышленного производства значительно возросла нагрузка на объекты окружающей среды, что выразилось ее значительным загрязнением токсичными соединениями [1-3]. Фенольные и сульфоароматические соединения, которые широко применяются в химической промышленности и в ряде случаев в значительных количествах попадают в водные экосистемы, относятся к классам поллютантов, наносящих существенный ущерб окружающей среде. Так, в мире, согласно литературным данным, ежегодно производится более 50000 тонн фенолов и пентахлорфенолов, 40000 тонн монохлорфенолов, более 2 млн. тонн сульфонатов. Соответственно, высок и уровень загрязнения окружающей среды в процессе производства. В частности, по Российской Федерации в 1999 году в поверхностные водные источники поступило 60 тонн фенолов; только по Архангельской области в 2002 году сброс фенола в поверхностные водные источники составил 5,5 тонн. Выраженная во всем мире тенденция к уменьшению антропогенного воздействия на окружающую среду приводит к ужесточению требований экологического законодательства. На многих предприятиях, в частности, на нефтеперерабатывающих заводах, принадлежащих корпорации Тюменская Нефтяная Компания & British Petroleum(ТНК-BP), вводятся в действие корпоративные стандарты по охране окружающей среды, соблюдение которых относится к приоритетным направлениям работы корпорации. В связи с этим задача обнаружения токсичных соединений, в частности, фенолов и сульфоароматических, в объектах окружающей среды относится к разряду актуальных. В арсенале аналитических методик обнаружения ксенобиотиков предпочтение отдается простым, надежным и оперативным методам и приборам на их основе. Одним из важных условий является снижение стоимости анализа. Применяемые в настоящее время физико-химические методы (масс-спектрометрия, хроматография, спектральный анализ) достаточно сложны и дорогостоящи [4, 5]. Исследования последних лет показали, что в качестве нового эффективного подхода к определению широкого спектра органических соединений, в том числе – токсичных, в образцах окружающей среды может быть использован метод биосенсорной детекции [6-9]. В этой связи интенсивно разрабатываются новые виды биосенсоров для решения задач экологического контроля. Важная роль в решении задач экологического мониторинга отводится микробным биосенсорам, которые перспективны как анализаторы в силу простоты и надежности конструкции, низкой стоимости биологического материала. Уникальной характеристикой микроорганизмов является их способность окислять широкий спектр органических соединений. Это дает возможность относительно простыми способами, используя принцип регистрации клеточного дыхания, формировать Биосенсоры для детекции различных органических соединений. Вместе с тем, несмотря на актуальность задачи обнаружения фенолов и сульфоароматических соединений, до настоящего времени не были описаны Биосенсоры микробного или другого типов для анализа п-толуолсульфоната, и имеется незначительное число публикаций, посвященных разработке ферментных и микробных биосенсоров для детекции фенола и его производных. Существующее положение в данной области и общая актуальность задачи определили постановку цели и задач исследования.

Цель исследования. Целью работы являлось создание биосенсоров электрохимического типа для детекции сульфоароматических и фенольных соединений на основе бактерий родов Comamonas и Pseudomonas, являющихся деструкторами п-толуолсульфоната и фенола, соответственно.

Были поставлены следующие задачи:

1. На основании имеющихся литературных данных произвести выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола и определить вид преобразования сигнала.

2. Оценить характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработать лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Оценить возможность использования колоночного и мембранного сенсоров.

3. Выполнить сравнительную оценку характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas.

4. Используя активный ил водоочистных сооружений в качестве биологического материала в реакторе с непрерывной подачей субстрата, оценить параметры процесса очистки промышленных стоков от фенола. На основании полученных данных представить предложения по оптимизации процесса очистки сточных вод нефтеперерабатывающего производства.

Научная новизна работы. На основании имеющихся литературных данных произведен выбор штаммов, обладающих характеристиками, требуемыми для формирования биорецепторного элемента сенсоров для детекции п-толуолсульфоната и фенола, и экспериментально показано, что эффективным типом преобразователя является кислородный электрохимический электрод для регистрации содержания кислорода в среде. Оценены характеристики процесса деградации п-толуолсульфоната свободными и иммобилизованными клетками Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) в периодических и непрерывных условиях. Разработаны лабораторные макеты биосенсоров на основе бактерий Comamonas testosteroni BS1310 (pBS1010) и бактерий рода Pseudomonas с использованием амперометрической детекции (кислородного электрода типа Кларка). Выполнена сравнительная оценка характеристик биосенсоров для детекции п-толуолсульфоната на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов C. testosteroni BS1310 (pBS1010) и для детекции фенола на основе плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Pseudomonas. Показано, что сенсоры, основанные на плазмидсодержащих бактериях, обладают высокой селективностью в отношении целевых соединений, которая резко снижается при использовании бесплазмидных штаммов. Полученные сравнительные оценки субстратной специфичности плазмидного и бесплазмдного штаммов носят характер фундаментальных результатов и могут быть эффективно использованы для развития научных основ и практического применения биосенсоров.

Практическая значимость. Метод, основанный на биосенсорной детекции п-толуолсульфоната и фенола, может быть использован в научных исследованиях для определения концентрации указанных соединений в пробах, не содержащих других компонентов; так, метод может быть полезен при решении задач, связанных с оценкой каталитической активности in vivo ферментных систем микроорганизмов-деструкторов п-толуолсульфоната и фенола в процессе их утилизации.

Разработанные модели биосенсоров могут составить основу аналитических приборов для проведения экологического мониторинга, основанных на одновременном измерении проб двумя сенсорами, включающими плазмидный и бесплазмидный штаммы, соответственно. Такие системы могут явиться высокоэффективными не только для определения абсолютных значений концентрации поллютантов в образцах, но, в первую очередь, для оценки эффективности процессов, связанных с относительным изменением содержания целевого соединения в образце, например, в процессе очистки сточных вод химических предприятий.

Результаты, полученные при изучении разложения п-толуолсульфоната в лабораторных условиях, могут быть использованы при проектировании промышленных реакторов для разложения ТС и фенола, содержащегося в сточных водах, а также для разработки биосенсора колоночного типа.

Качественная оценка процесса деградации фенола иммобилизованным активным илом позволила представить рекомендации по оптимизации очистки сточных вод нефтехимического предприятия, в результате которых была увеличена на 17% эффективность очистки. Предложен метод оценки окислительной активности микроорганизмов активного ила с помощью аналога колоночного сенсора.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

Аэробные микроорганизмы-деструкторы при разложении целевого вещества потребляют кислород. Этот процесс можно использовать при создании микробных сенсоров для детекции целевого соединения. Поэтому поиск штаммов, пригодных для использования в биорецепторах сенсоров целесообразно проводить среди штаммов-деструкторов соответствующих соединений.

Плазмидная детерминированность катаболизма целевого соединения позволяет создавать пару на основе двух вариантов одного штамма, один из которых содержит плазмиду биодеградации, а второй не содержит. В этом случае спектр деградируемых веществ у этих двух вариантов будет отличаться только целевым соединением. Сигнал на целевое соединение в этом случае можно будет отделить от сигналов на мешающие вещества.

Биосенсорный подход применим для решения практических задач с помощью аналога колоночного сенсора на основе бактерий активного ила. Этот сенсор позволяет произвести качественную оценку состояния активного ила аэрируемых биологических очистных сооружений. Кислородный электрод Кларка применим для оптимизации работы аэрируемых биохимических очистных сооружений промышленных предприятий.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, экспериментальной части и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах, содержит 15 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель содержит 207 источников литературы.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были доложены на международных и российских конференциях: "Биокатализ-98" (Пущино, 1998), "Проблемы, способы и средства защиты окружающей среды от загрязнений нефтью и нефтепродуктами (3-я Научно-техническая конференция, Москва, 1999), Всероссийская конференция с международным участием "Сенсор - 2000" (Санкт-Петербург, 2000), "Проблемы медицинской и экологической биотехнологии" (Оболенск, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2001). Всего по материалам диссертации опубликовано 13 работ – 8 публикаций материалов конференций, 3 статьи в журнале «Прикладная биохимия и микробиология», статья в «Известиях ТулГУ», статья в журнале «Экологические системы и приборы».

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биосенсоры как направление в аналитической биотехнологии.

Вторая половина 20 века охарактеризовалась интенсивным развитием биотехнологии и появлением в ней нового направления – аналитической биотехнологии. В свою очередь значительную роль в развитии аналитической биотехнологии сыграли исследования в области биосенсоров - аналитических приборов, представляющих собой комбинацию биологического материала с физико-химическими устройствами, называемыми преобразователями. Назначением биоматериала являлось обнаружение заданного соединения в пробе, назначением преобразователя являлась регистрация протекающей биохимической реакции и формирование электрического сигнала, свидетельствующего о взаимодействии анализируемого соединения с биоматериалом. Впервые биосенсорный принцип анализа сформулировал американский профессор Л. Кларк в своем выступлении на симпозиуме Нью-Йоркской Академии наук в 1962 г [10]. Он же являлся и автором первой действующей модели биосенсора, предназначенного для быстрого обнаружения глюкозы в пробе. В настоящее время исследования в области биосенсоров характеризуются высокой интенсивностью, направленностью на решение практических задач, поиском биоматериалов нового типа, совершенствованием аналитических параметров [8, 9, 11].

В обзоре во вводной части кратко рассмотрены типы преобразователей и биоматериалов, составляющие основу биосенсоров, вторая, основная часть, посвящена анализу вопроса об использовании клеток микроорганизмов для биосенсорной детекции различных целевых соединений.

2.1. Типы преобразователей, используемых в биосенсорах. Электрохимические преобразователи

При разработке сенсоров используются электрохимические[8-15], пьезоэлектрические [16-18], оптические преобразователи [19-25], магнитные преобразователи [26], химические сенсоры [27-32].

В биосенсорных аналитических системах широко используются электрохимические преобразователи вследствие простоты исполнения и надежности функционирования. В качестве электрохимических преобразователей используются амперометрические и потенциометрические электроды (Н+, СО2, NH3+ - селективные электроды, ионселективные полевые транзисторы), кондуктометрические ячейки [8, 12]. Рабочий диапазон детекции потенциометрических сенсоров заключен в пределах от 10-1 до 10-5 М, амперометрических – от 10-3 до 10-9 М [14]. Амперометрический принцип удобен при создании сенсоров на основе аэробных микроорганизмов.

При амперометрическом детектировании измеряемый ток непосредственно определяется скоростью биоэлектрохимической реакции, протекающей на индикаторном электроде [8, 13]. Поверхность амперометрических электродов модифицируется различными способами с целью придания им требуемых качеств и улучшения рабочих характеристик [33]. Для повышения селективности применяется создание специфичных мембран, использование высокоактивных электродных материалов, применение медиаторов [34]. Амперометрические электроды успешно применяются в биологических исследованиях, в частности, в клинической биохимии, где из-за большого числа образцов и необходимости экспресс-анализа многие сложные методы непригодны [8]. Одним из наиболее простых и надежных типов преобразователей является амперометрический метод измерения уровня кислорода в среде. Он широко применяется для создания биосенсоров на основе амперометрического микробных клеток для детекции органических соединений [15].

2.2. Типы биологических материалов, применяемых в рецепторных элементах биосенсоров

2.2.1. Сенсоры на основе ферментов, иммунных комплексов, молекул ДНК, животных и растительных клеток, клеточных органоидов

Сенсорные системы на основе ферментов широко используются в медико-биологической практике. Для эколого-аналитического контроля они применяются значительно реже ввиду сложности состава природных и сточных вод и возникающих артефактных сигналов. Кроме того, недостаточно изучено воздействие токсичных соединений на механизм ферментативного катализа. Однако, поскольку ферментные сенсоры обладают высокой селективностью, данное направление является перспективным для экологического мониторинга [34].

Создан ряд ферментных сенсоров для детекции фенола и его производных; в частности, путем иммобилизации тирозиназы в осмиевом полимере на основе поливинилимидазола [35], на стеклоуглеродном электроде [36, 37], в полиэстерсульфоновой кислоте [38], углеродной пасте [39-42], на поверхности графитового электрода [43], на эпоксиграфитные электроды [44-46], в парафин-графитную среду [47], в трвердографитной пасте [41], в металлоуглеродную пасту [48], на карбамид-активированном электроде [49], на твердом графитном электроде [42], в поливиниловый спирт [50]. Сенсор на основе тирозиназы использовали для определения фенола в проточной системе [51]. Разработан цеолитный сенсор для определения фенола с пределом детекции 0.25×10-9М [52]. Созданы Биосенсоры, в которых тирозиназа коиммобилизована с другими ферментами, в частности, с хинопротеинглюкозодегидрогеназой [51], глюкозодегидрогеназой [53-55, 39], фенолоксидазой [56], пероксидазой хрена [57], холинэстеразой [58], полифенолоксидазой [59], глюкозодегидрогеназой [50]. Описан фенольный сенсор на основе лакказы [60]. Пределы детекции для фенола и его гомологов составляли от 20×10-9 до 10-6 М [37, 46, 49, 50, 61-63]. Время ответа для всех описанных сенсоров составляло несколько секунд. На основе тирозиназы предложен биосенсор, чувствительный к цианидам, хлорфенолам, атразину, ряду пестицидов [64]. Для детекции неорганического фосфата разработаны ферментные сенсоры с нижними пределами детекции 10-9 М [65] и 6×10-6 М [66]. Разрабатываются ферментные мультибиосенсоры для одновременного определения глюкозы, этанола, 1-лактата, 1-малата в образцах вина [67], для определения качества рыбных изделий по детекции продуктов распада белков [68, 69].

Принцип действия иммуносенсоров основан на взаимодействии исследуемого вещества (антигена) со специфически связывающимися с ним партнером (антителом) [8]. Эффективное применение иммуносенсоров в области аналитического контроля связано с высокой специфичностью реакции антиген-антитело и практически неограниченным числом соединений, для которых можно выделить иммунные комплексы [34]. К настоящему времени разработан ряд иммуносенсоров для экологического контроля [70, 71, 8]. Предложены модели иммуносенсоров для определения ароматических соединений, сахаров, белков [52, 8]. В частности, для детекции 2, 4 - дихлорфеноксиуксусной кислоты [72-74], тринитротолуола [75,76] и гексагидро-1, 3, 5-триазина [76], 4-нитрофенола [77], 2,4-динитрофенола в воздухе [22] и в образцах сточной воды [78] и для оценки общего содержания полициклических ароматических углеводородов в почве [79, 73], детекции микроорганизмов (Salmonella) [80]. Разрабатываются иммуносенсоры для клинической диагностики [81], определения инсулина человека [82], цитокинина [83], гербицидов и пестицидов [79, 81, 84], фенилоина и диоксина [85]. Нижние пределы детекции описанных иммуносенсоров составляют до 10-12М [85]. Описаны иммуносенсоры для детекции неорганических соединений, в частности, нитрата [86, 87] и нитрита [86-88].

Разрабатываются также сенсоры на основе олигонуклеотидов для детекции гибридизации ДНК и общей токсичности [89], клеточных органоидов [90, 91], нервных клеток [26], других клеток животных, в частности, миокардиоцитов цыпленка [92].

2.2.2. Сенсоры на основе микробных клеток

Использование микробных биосенсоров характеризуется рядом преимуществ: более низкой стоимостью и трудоемкостью изготовления биорецептора ввиду исключения стадий очистки и выделения фермента. В ряде случаев возможно повышение стабильности биосенсора, поскольку ферменты внутри клетки находятся в естественных, оптимальных условиях [93].

Первый микробный сенсор был разработан Divies в 1975 г для определения этанола с использованием клеток Acetobacter xylinum [94]. В настоящее время разработаны микробные сенсоры для определения широкого спектра соединений.

По своим параметрам (чувствительности, скорости ответа, воспроизводимости показаний) микробные сенсоры близки к ферментным, однако обладают более низкой селективностью, что обусловлено многообразием ферментативных систем клеток. Решением данной проблемы – повышением селективности - является ингибирование нежелательных метаболических путей и систем путем культивирования с соответствующим субстратом [95]. Незначительные затраты на получение биомассы, а также стабильность рецептора в ряде случаев делают использование микробных сенсоров предпочтительным по сравнению с другими типами биосенсоров.

Микроорганизмами, используемыми в биорецепторе, чаще всего являются прокариоты. Описаны микробные сенсоры на основе бактерий практически всех систематических групп [96], некоторых грибов, в частности Aspergillus ustus [97], одноклеточных зеленых водорослей Chlamydomonas [98] и Scenedesmus Subspicatus [99], дрожжей [100]. Разработано большое количество датчиков с использованием микроорганизмов для определения сахаров, спиртов, органических кислот, витаминов, антибиотиков, стероидов, пептидов, ферментативных активностей, аммония, нитратов, нитритов, сульфидов, фосфатов, БПК. Достижения в области микробных сенсоров отражены в книге [8].

Разрабатываются также микросенсоры на основе микроорганизмов, в которых роль электрода играет платиновая проволока диаметром в несколько микрон. Микроскопические сенсоры имеют ряд преимуществ, так, они не нуждаются в перемешивании среды, поскольку диффузия в микроскопических масштабах происходит значительно эффективнее. Следовательно, может быть достигнут более низкий предел детекции [101].

В микробных сенсорах субстрат для взаимодействия с ферментом должен транспортироваться через мембрану клеток. В связи с этим времена генерации сигналов ответов для микробных сенсоров более высокие, чем для ферментных. Физиологические характеристики микроорганизмов, используемых в биорецепторном элементе микробного сенсора, в частности, дыхательная активность [102], зависят от рН, формируются под влиянием условий лимитирования по субстрату и определяют чувствительность, специфичность и стабильность биорецептора. Электрохимические продукты трансформации химических соединений, осуществляемой ферментативными системами микроорганизмов (H+, NH4+, H2O2, CO2 и др.), либо поглощение кислорода, происходящее в процессе реакции, могут быть зарегистрированы электрохимическими методами (амперометрия или потенциометрия). Ответная реакция микробного сенсора на изменение состава среды представляет собой среднее из показателей миллионов отдельных организмов, что обеспечивает наиболее объективные и достоверные результаты [103].

Разработаны микробные сенсоры для мультикомпонентного анализа [104, 105]. Принцип действия сенсора основан на том, что для различных чистых органических веществ влияние на метаболизм микроорганизмов приводит к индивидуальной зависимой от времени в динамике падения концентрации кислорода. Данные хемометрического анализа подтвердили, что сигналы на отдельные вещества в смеси имеют линейный характер и являются добавочными. Таким образом, возможен анализ многокомпонентной смеси с использованием одного динамического микробного сенсора [105].

Областью применения микробных сенсоров является пищевая промышленность, контроль ферментационных процессов, диагностика ряда заболеваний, анализ объектов окружающей среды. Последний аспект применения микробных сенсоров будет рассмотрен подробнее.

2.2.2.1. Микробные сенсоры в мониторинге газовых и водных сред.

2.2.2.1.1. Мониторинг атмосферы

Одним из аспектов отрицательного влияния промышленной деятельности человека на атмосферу является увеличение концентрации СО2, приводящее к парниковому эффекту. Помимо углекислого газа в атмосферу выбрасываются большие количества NO2, NH3, SO2, SO3, CH4 и других токсичных веществ. Биосенсорная детекция перспективна для мониторинга CO2, NO2, NH3, CH4.

В настоящее время разработаны сенсоры для определения СО2 с использованием автотрофных микроорганизмов на основе кислородного электрода с линейным диапазоном концентраций СО% и временем жизни более 1 месяца [106]. Для определения СО2 в водном растворе создан сенсор на основе почвенных бактерий S - 17, выделенных из префектуры Akita, Japan [107] и кислородного электрода с линейным диапазоном детекции 200ррМ СО2 (8×10-3М К2СО3) и нижним пределом детекции 5 ррМ СО2 (200 ×10-6 мкМ К2СО3). Верхний предел определялся насыщением СО2 в буферном растворе. Время ответа сенсора составляло 2 - 5 мин, время жизни - более 3 недель при 30оС [107].

Микробный сенсор на основе клеток Thiobacillus thioparus, иммобилизованных между двумя нитроцеллюлозными мембранами, и кислородного электрода, использовался для определения SO3 [108]. Амперометрический сенсор на основе Nitrobacter sp., который метаболизирует нитриты в качестве единственного источника энергии, был применен для их детекции [109].

Описан амперометрический датчик для определения аммония в сточных водах на основе двух штаммов нитрифицирующих бактерий, способных производить деградацию аммония с потреблением кислорода. Показана возможность его применения для мониторинга атмосферы [110]. Разработан сенсор для детекции NH4+, содержащий иммобилизованные микроорганизмы (Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Trichosporon cutaneum) в соединении с электрохимическим преобразователем. Время ответа сенсора составилос, линейный диапазон концентраций от 5×10-9 до 15×10-8 М аммония и время жизни 12 дней [15]. В работе [111] достигнут нижний предел детекции NH4+ 6×10-9 М.

Предложен микросенсор для определения NO с временем ответа 1 мин и временем жизни несколько дней. Единственным мешающим соединением для данного сенсора являлся N2O [101].

Предел детекции амперометрического сенсора для определения летучих органических соединений в форме аэрозолей, в частности перхлорэтилена (тетрахлорэтилена) с использованием микроводоросли Chlorella, составил 10 ррМ. Сенсор обладал линейным диапазономррМ и временем полужизни 8 дней [112]. Данный метод может быть применим для веществ, влияющих на фотосинтез.

2.2.2.1.2. Мониторинг гидросферы

Отрицательное влияние промышленной деятельности человека сказывается и на состоянии поверхностных и подземных сточных вод, биосфере мирового океана. Для мониторинга водных поллютантов также предложен ряд биосенсоров. Так, биосенсор для детекции Н2О2 создан на основе Bacillus subtilis AS1398. Рабочий диапазон сенсора составлял×10-3 М, время жизни 65 дней. Сенсор характеризовался высокой селективностью и воспроизводимостью [113].

Биосенсор для определения концентрации формальдегида на основе клеток метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha Аи потенциометрических рН-чувствительных полевых транзисторов обладал линейным диапазоном от 2×10-3 до 200×10-3 М, временем жизни 42 ч при введении проб каждые 20 мин и нижним пределом детекции 0.5×10-3 М [114]. На основе lux-меченых бактерий разработан сенсор для детекции фенантрена, пирена, бензапирена [115].

Escherichia coli DH5a с геном alk из Pseudomonas oleovorans использована в качестве биорецептора сенсора для определения алканов. Для октана диапазон детекции составил 24 ×10×10-9 М [116]. Гриб Aspergillus ustus применили в сенсоре для определения танниновой кислоты. Рабочий диапазон сенсора составил (0.×10-3 М [87].

С помощью микробных биосенсоров можно производить детекцию высокомолекулярных соединений. Так, на основе клеток Nocardia opaca, иммобилизованных в полиакриламид, и вращающегося стеклоуглеродного электрода разработан сенсор для определения стероидов с диапазоном детекции 2.5×10-9 – 0,1×10-6 М [117]. Детекция микотоксинов (катулин, ронефортин, токсин Т - 2) была возможна с помощью Tetrahymena termophyla [118]. Для определения концентрации цитохрома применен цианид-устойчивый Klebsiella oxytoca [119].

Сенсор, чувствительный к спектру флуоресценции фикоцианина, способен обеспечить облегченный мониторинг концентрации цианобактерий и предупредить о наступлении сезона цветения водорослей [20]. Предлагается биосенсор для мониторинга концентрации Chatomella marina , которая является основной составляющей красных приливов, на основе хемилюминесценции, происходящей в результате образования супероксидов этими водорослями [120].

2.2.2.2. Классы соединений, детектируемых с помощью микробных биосенсоров

2.2.2.2.1. Определение БПК

Биохимическое потребление кислорода (БПК) как индикатор количества биодеградабельных органических компонентов широко используется для контроля качества очистки сточных вод. Общепринятый тест на БПК занимает 5 дней и вследствие этого непригоден для использования в процессах прямого контроля. Более быстрая оценка БПК возможна при использовании электрохимического микробного сенсора.

Традиционный метод БПК5 позволяет в основном определить сумму растворенных высокомолекулярных органических соединений, с помощью биосенсора можно определить также и низкомолекулярные биодеградабельные органические соединения в сточной воде. Критерием подбора микроорганизмов для использования их в БПК-сенсоре является широкий спектр потребляемых субстратов. Поэтому часто в биорецепторе таких сенсоров используются активированные илы, получаемые из отработанных сточных вод заводов и содержащие смешанные популяции микроорганизмов, поскольку отдельно взятый вид имеет узкий по сравнению с консорциумом спектр субстратов и может детектировать лишь часть компонент сточных вод [121, 122]. Однако, сенсоры на основе бактерий активного ила, как правило, дают трудновоспроизводимые сигналы.