Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере (стр. 2 )

Таблица 2.

Методы исследований.

Объект	Крысы Вистар
Модель	Кровопотеря 2% от массы тела
Показатели
Иммунная реактивность	ГИО (гуморальный иммунный ответ)	АОК (антителообразующие клетки)
ГЗТ(гиперчувствительность замедленного типа)	РМЛ (разница массы лимфоузлов)
Функционально-метаболическая активность нейтрофилов	Фагоцитарная активность	ФИ (фагоцитарный индекс)	ФЧ (фагоцитарное число)
Кислородзависимая активность	НСТ-сп. (тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный)
НСТ-инд. (тест восстановления нитросинего тетразолия индуцированный)
Энергетический, антиоксидантный статус и ПОЛ эритроцитов	Энергетичский статус	БФГ (бифосфоглицерат)	АТФ (аденозинтрифосфат)
Антиоксидантный статус	СОД (супероксиддисмутаза)	ГП (глутатионпероксидаза)
Каталаза	ГР (глутатионредуктаза)
ПОЛ	МДА (малоновый диальдегид)	ДК (диеновые коньюгаты)
Метаболические маркеры клеток крови	Полиморфноядерные лейкоциты:	Активность НАДФН-оксидазы
Лимфоциты:	Содержание фруктозо-2,6-дифосфатазы
Эритроциты:	Активность Mg2+-АТФ-азы
Тромбоциты:	Содержание МДА
Метаболическое состояние гепатоцитов	АЛТ (аланинаминотранс-фереза)	АСТ (аспартатаминотранс-фераза)	ЩФ (щелочная фосфатаза)	ОБ (общий билирубин)	Скорость биотрансформации тиопентала натрия
Иммуномодулирующие соединения крови	ГАГ (гликозаминогликаны)	ЛНП (липопротеиды низкой плотности)	ААП (α1-антипротеазы)	АМГ (α2-макроглобулины)

О выраженности ГИО судили по количеству АОК и РОК в селезенке. Индукцию иммунного ответа проводили эритроцитами барана ( 1968). Антиген вводили внутрибрюшинно в дозе 108 клеток на 1 кг массы тела. Число АОК к ЭБ устанавливали методом прямого, локального гемолиза в агаре ( 1987). Количество иммунных РОК определяли по Х. Зауэр (1987). Для определения выраженности ГЗТ сенсибилизирующую дозу ЭБ (106) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу ЭБ (108), а в подушечку левой лапки вводили 0,15 М хлорид натрия. О выраженности ГЗТ судили по величинам разницы массы регионарных и контралатеральных лимфатических узлов спустя 24 ч. после введения разрешающей дозы ( и др., 1993) (табл. 2).

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латекса размером 1,5-2 мкм. Рассчитывали: фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, индекс активности фагоцитоза (, , 1991). Кислородзависимую активность полиморфноядерных лейкоцитов оценивали по показателям НСТ-тестов спонтанного и стимулированного зимозаном и по общему резерву нейтрофилов – разнице между спонтанным и стимулированным тестами (, 1989) (табл. 2).

Спленоциты получали из ткани селезенки, которую извлекали в асептических условиях и измельчали ножницами в чашках Петри. Полученную тканевую массу разбавляли средой 199, гомогенизировали в гомогенизаторе Поттера-Уэлса и центрифугировали 10-15 минут при 200 g. Суспензию фильтровали через капроновые сетки и дважды отмывали средой 199 в течение 10 минут при 200 g. Эритроциты удаляли гемолитическим шоком ( 1979). Клетки селезенки фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре ( и др., 1985). Прилипающие и не прилипающие клетки инкубировали в среде клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин), в течение 4-6 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% двуокиси углерода) и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Белки супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-150. Получали три фракции белков: фракция I содержала белки с молекулярной массой более 150 кД, фракция II – белки с молекулярной массой 50-60 кД и фракция III – белки с молекулярной массой менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорд. Активность фракций оценивали путем внесения их в среду инкубации ПЯЛ.

Выделение эритроцитов проводили следующим образом. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН = 7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 2% декстрана Т-500 в течение 30 мин при 37°С. Затем кровь центрифугировали (3000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С). Слой эритроцитов удаляли аспирацией. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на хроматографической колонке, содержащей HBS-целлюлозу в 10 мМ Na-фосфатном буфере, содержащем 0,9% хлорида натрия. После очистки эритроциты осаждали центрифугированием (3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С) (Beutler, 1985). Эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина ( и др., 1978). Для приготовления градиента носителя навеску сухого яичного альбумина растворяли в буферном растворе (рН = 7,8). Готовили ряд пробирок, содержащих 1 мл раствора яичного альбумина: 1 пробирка - конц. 28% (d = 1,079 г/см3), 2 пробирка - конц. 30% (d = 1,091 г/см3), 3 пробирка - конц. 40% (d = 1,105 г/см3), 4 пробирка - 43% ( d = 1,117 г/см3). Взвесь эритроцитов (5 х 109 клеток в 0,5 мл среды 199) наносили на раствор альбумина в первую пробирку и центрифугировали при 1400 g в течение 10 мин. Верхняя зона представляла собой легкие эритроциты (плотность ниже 1,079 г/см3). Нижнюю зону переносили во 2 пробирку и центрифугировали, верхнюю зону клеток отбрасывали, а нижнюю переносили в третью пробирку. После центрифугирования отделяли эритроциты верхней зоны, имеющие плотность 1,091-1,105 г/см3 (промежуточная по плотности фракция), а клетки нижней зоны вносили в 4 пробирку. После центрифугирования отделяли нижнюю зону клеток. Это фракция тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117.

Полученные фракции эритроцитов тщательно отмывали от альбумина 0,15 М хлоридом натрия и использовали для введения аллогенным животным.

Спленоциты культивировали с аллогенными эритроцитами или их фракциями в соотношении клеток 1:2 (5 х 107 лимфоцитов и 108 эритроцитов на 3 мл среды) в среде х 107 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин, стрептомицин), в течение 4 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа). По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 минут и готовили пул надосадочных жидкостей, содержащих равные объемы жидкостей 5-6 животных.

Пул жидкости диализовали в течение 12-15 часов против 50 кратного объема 0,05 М трис-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М хлориде натрия. После диализа его концентрировали полиэтиленгликолем (ММ 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1-буфера). Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость осаждали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием при 800 g в течение 20 минут. Концентрацию белка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Бредфорду, используя краситель Кумаси G-250 (, 1982).

Активность надосадочных жидкостей и их фракций определяли путем добавления их к взвеси мононуклеаров в объеме, содержавшем 100 мкг белка, и последующего определения показателей ФМА мононуклеаров.

Выделение стабильного метаболита оксида натрия лейкоцитами определяли спектрофотометрически с использованием реактива Грисса ( и др., 2003). Активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов определяли по и др. (2001), содержание фруктозо-2,6-дифосфата (ФДФ) в лимфоцитах – по и др. (1999). В строме эритроцитов определяли суммарную активность Na+, K+-АТФазы и Mg2+-АТФазы (, , 2005). Активность последней устанавливали в присутствии дабалена, ингибирующего Na+, K+-АТФазу. В тромбоцитах определяли содержание МДА (, 1992) (табл. 2).

Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке ЛНП (, Камышников B. C., 1976), ДК и МДА (, 1977; и , 1977), ГАГ ( и др., 1986), активности антипротеолитических белков - АЛЛ и АМГ (, , 1979). Иммуностимулирующую активность сыворотки оценивали по концентрации АНК ( и Камышников B. C., 1976), активности протеолитических ферментов (, 1969) и лизоцима (, , 1974) (табл. 2).

В эритроцитах определяли содержание макроэргических соединений (БФГ и АТФ) ( и др., 1980) и активность антиоксидантных ферментов (СОД и ГР) (, 1988) (табл. 2).

ГАГ выделяли из соцветий лекарственных растений Polygonaceae (ГАГ-Р), Tiliaceae (ГАГ-Т) и Astraceae (ГАГ-А) по способу и др. (а. с. № 000). Способ включает экстракцию 5% раствором серного эфира в этаноле и очищение горячей (95 ºС) водой, деминерализацию путем переосаждения этанолом и диализом, дополнительную деминерализацию ионитами, очистку от белковых примесей, обработкой смесью хлороформа и этилового спирта и щелочного омыления гетерополисахаридного комплекса. Количественный и качественный состав выделенных полисахаридов изучен и описан ранее. Полученные соединения являются глюкуроногликанами, в состав которых входят D-галактуроновая кислота (60-80%), галактоза (15-19%), глюкоза (6-12%), арабиноза (4-8%) и рамноза (5-10%) ( и др., 1985, 1988).

Получение эритроцитов, обработанных ГАГ-P и менадионом. Эритроциты здоровых крыс и животных, потерявших 2% крови, инкубировали в растворах, 1 мл которых содержал 1, 2 или 3 мг ГАГ-Р или 1, 2 или 3 мг менадиона. К 1 мл раствора добавляли 107 эритроцитов и инкубировали 30 минут при 37 ºС.

Для включения менадиона в строму эритроцитов использовали метод гипоосмотического гемолиза ( и др., 1988; , , 1990) Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течении 5 мин при 4°С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0°С дистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g в течении 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем менадиона, растворенного в охлажденной до 5°С дистиллированной воде. Концентрация препарата в инкубационной среде составляла 1, 2 или 3 мг/мл. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% хлорида натрия для восстановления целостности стромы и инкубировали в течении 30 мин при 37°С. После включения менадиона в стромальные сферы, последние дважды отмывали изотоничеким раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500 g в течении 10 мин.

Включение ГАГ в строму эритроцитов осуществляли методом гипоосмотического гемолиза (см. выше). О включении ГАГ в строму судили по увеличению в среде гексуроновых кислот после полного гемолиза стромальных сфер (, 1982).

СЭОГ и СЭОМ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 108 частиц на 1 кг массы тела. Одновременно с первой инъекцией СЭОГ или СЭОМ животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, которым вводили строму эритроцитов, не обработанную препаратами.

Статистическая обработка материала. Вычисляли средние арифметические величины определявшихся показателей и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента (, 1980), Вилкоксона, Манна-Уитни (, , 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов и гликозаминогликанов при кровопотере. Внутрижелудочное введение ГАГ, выделенных из растений семейства Teliaceae, Asteraceae и Polygonaceae (ГАГ-Т, ГАГ-А и ГАГ-Р) интактным крысам не влияло на развитие у них ГИО и ГЗГ, индуцированных ЭБ. Внутримышечное введение ГАГ интактным животным стимулировало развитие ГИО, но не влияло на ГЗГ. Наиболее выраженный стимулирующий эффект вызвало введение ГАГ-Р.

Потеря 2% крови угнетала развитие ГИО и ГЗТ, подавляла функционально-метаболическую активность лейкоцитов периферической крови, снижала содержание БФГ, АТФ, активность СОД и ГР в эритроцитах, повышала концентрацию АГП и МДА, активность АЛТ, АСТ, ААП, АМГ, ЩФ и содержание ОБ в плазме крови. По-видимому, после потери 2% крови иммуносупрессирующий эффект вызываемый повышением интенсивности ПОЛ усиливается нарушением функций гепатоцитов и накоплением в крови ААП и АМГ, обладающих выраженными иммуносупрессорными свойствами ( и др., 1998).

Установлено, что внутримышечное и внутрижелудочное введение ГАГ-Р в сочетании с РА или ТА корригирует ГИО и ФМА нейтрофилов и не влияет на развитие ГЗТ. Комбинированное применение ГАГ-Р и филлохинона или менадиона частично или полностью корригирует клеточный и гуморальный иммунный ответ и ФМА полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови КПК (табл. 3).

После кровопотери легкие эритроциты приобретали иммуносупрессирующие свойства. Введение ГАГ-Р и менадиона ослабляло иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов и индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Полученные данные свидетельствуют о существенной роли эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия совместного применения ГАГ и менадиона при кровопотере.

Таблица 3.

Влияние сочетанного применения гликозаминогликанов растительного происхождения с жирорастворимыми витаминами на иммунитет крыс после кровопотери.

№ п/п	Условия опыта	ГИО	ГЗТ	Функциональная активность нейтрофилов
1.	Кровопотеря	Угнетение	Угнетение	Угнетение
2.	Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и ретинола ацетата	Коррекция	Нет эффекта	Коррекция
3.	Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и токоферола ацетата	Коррекция	Нет эффекта	Коррекция
4.	Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и филлохинона	Нормализация	Нормализация	Нормализация
5.	Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Polygonaceae и менадиона	Нормализация	Коррекция	Нормализация

Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов Polygonaceae и менадиона, иммобилизованных стромой эритроцитов после кровопотери. Наиболее простым способом фиксации лекарственных препаратов на нерастворимом в водной фазе носителе является адсорбция их на цитоплазматической мембране эритроцитов. Известно, что инкубация эритроцитов в растворах, содержащих ферменты и фосфолипиды, приводила к появлению у этих клеток иммуномодулирующих свойств ( и др., 1998). Выраженное влияние на иммуномодулирующие свойства эритроцитов оказывает менадион. Принимая во внимания изложенное, были изучены иммуномодулирующие свойства ГАГ-Р и менадиона соиммобилизованных на эритроцитах и их строме.

После инкубации с ГАГ-P, эритроциты интактных крыс приобретали свойство стимулировать развитие иммунного ответа у здоровых животных и крыс после кровопотери, причем, наиболее выраженными иммуномодулирующими свойствами обладали эритроциты, инкубированные в среде, содержащей 3 мг/мл ГАГ-P.

Инкубация с ГАГ-Р не индуцировала у эритроцитов, полученных у КПК после кровопотери свойства модулировать развитие гуморального иммунного ответа у здоровых животных и крыс, потерявших 2% крови. Полностью неактивными были также эритроциты инкубированные с менадионом. Эти наблюдения показывают, что после кровопотери мембрана эритроцитов становится рефрактерной к раздельному действию ГАГ-P и менадиона.

Принимая во внимание изложенное, было изучено иммуномодулирующее действие стромы эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанной ГАГ-P или менадионом.

СЭОГ и СЭОМ стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ у здоровых животных. Наиболее выраженная стимуляция имела место при введении частиц, полученных при содержании в инкубационной среде 2 и 3 мг/мл ГАГ-P. После кровопотери СЭОГ повышала, но не до уровня контрольной группы, а СЭОМ – не влияла на развитие различных форм иммунного ответа на ЭБ. Изучена также иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов, полученных после кровопотери и инкубированной с ГАГ-P или менадионом. Оказалось, что введение стромы, обработанной ГАГ-P в дозе 2 мг/мл до или после кровопотери, вызывало слабо выраженный иммуномодулирующий эффект, а инъекции стромы, инкубированной с менадионом или с ГАГ-P в дозе 1 и 3 мг/мл – не влияли на выраженность иммунной реакции, индуцированной ЭБ. На основании этих экспериментов можно прийти к заключению, что компоненты структуры стромы эритроцитов крыс, потерявших 2% крови, в процессе гемолиза претерпевают изменения, ослабляющие или предотвращающие взаимодействия с ними изученных соединений.

Принимая во внимание то обстоятельство, что цельные тяжелые эритроциты, инкубированные с ГАГ-P, приобретают иммуностимулирующие свойства, а клетки, обработанные аналогичным образом менадионом, остаются иммунологически неактивными, возникло предположение, что инкубация СЭОМ с ГАГ-P повысит стабильность и увеличит иммуномодулирующую активность стромальных частиц. Для проверки этого предположения СЭОМ, полученные на основе клеток интактных животных и крыс, подвергнутых кровопусканию обрабатывали in vitro ГАГ-P 2 мг/мл и полученные частицы (СЭОМГ) вводили животным до или после кровопотери.

Оказалось, что СЭОМГ интактных крыс стимулировала развитие иммунного ответа у здоровых животных в значительно большей степени, чем СЭОГ. Об этом свидетельствовал тот факт, что у животных, получавших инъекции СЭОГ, количество АОК в селезенке было в 3,2 раза выше, чем в контроле, а у крыс, которым вводили СЭОМГ, эти параметры превышали контрольный уровень соответственно в 4,9 и 3,5 раза (табл. 4). В отличие от СЭОГ, СЭОМГ нормализовал развитие иммунного ответа после кровопотери. Принципиально важным является тот факт, что СЭОМГ, полученный на основе клеток, выделенных после кровопотери в отличие от СЭОГ стимулирует развитие гуморальной иммунной реакции на ЭБ у здоровых и КПК (табл. 4).

Таблица 4.

Влияние стромы эритроцитов интактных животных и КПК,
последовательно обработанной меналионом и ГАГ-P, на развитие
иммунного ответа у здоровых животных и КПК.

№ п/п	Условия опыта	Здоровые животные	КПК
АОК	РМЛ	АОК	РМЛ
1.	Контроль (без введения стромы)	25,4±2,7	5,7±0,5	7,1±0,9	2,3±0,2
2.	Введение СЭОГ интактных животных	81,3±8,4*1	9,1±1,0*1	16,4±1,8*1	3,9±0,3*1
3.	Введение СЭОМГ интактных животных	124,5±14,3*1,2	8,8±0,9*1,2	27,0±2,9*1,2	5,2±0,5*1,2
4.	Введение СЭОГ КПК	24,8±2,6	5,0±0,5	7,2±0,8	2,5±0,3
5.	Введение СЭОМГ КПК	83,5±8,8*1,2	4,8±0,4*1,2	22,9±2,8*1,2	5,7±0,5*1,2

Примечание: здесь и на последующих таблицах: 1. * - p<0,05; 2. – цифра рядом со звездочкой указывает на группу, по отношению к которой различия достоверно.