Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере (стр. 3 )

Таким образом, обработка стромы эритроцитов менадионом повышает чувствительность ее структур к модифицирующему действию ГАГ-P. Механизм этого эффекта остается неясным. Можно лишь предположить, что при взаимодействии менадиона с соединениями стромы эритроцитов, образуются структуры, модифицирующие состояние фосфолипидного каркаса мембраны эритроцитов и повышающие эффективность связывания с ними ГАГ-P.

Иммуномодулирующее действие модифицированных лекарственными соединениями эритроцитов обусловлено цитокинами, выделяемыми моноцитарно-макрофагальными и лимфоидными клетками селезенки (, 2001). Не исключено, что аналогичный механизм реализуется при введении в организм модифицированной стромы эритроцитов. Для проверки этого предположения клетки селезенки крыс, подвергнутых кровопусканию и получавших инъекции СЭОМГ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре среды, культивировали в течение 6 ч, получали супернатант и тестировали его на наличие иммуномодулирующей активности. Установлено, что супернатант клеток, прилипающих к стеклу при 4-10 ºС супрессирует у аллогенных животных развитие иммунного ответа на ЭБ. Супернатант неприлипающих клеток увеличивает выраженность иммунной реакции, но в меньшей степени, чем супернатант прилипающих при 32-37ºС клеток (табл. 5).

Фракция III супернатанта неприлипающих клеток при аллогенном переносе стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракционированного супернатанта. Остальные фракции супернатанта неприлипающих клеток не влияли на выраженность реакции индуцированной ЭБ. Фракция II клеток, прилипающих при 4-10 ºС, обладала иммуносупрессирующей активностью, а фракция III клеток, прилипающих при 32-37 °С – иммуностимулирующими свойствами.

Клетки моноцитарно-макрофагального ряда выделяют пептиды, оказывающие влияние не только на функциональную активность иммуноцитов, но обладающие также антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами ( и др., 1992). Определение антиоксидантной и гепатопротекторной активности прилипающих и неприлипающих клеток селезенки крыс, потерявших 2% крови, получавших инъекции СЭОМГ, показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37 ºС снижает содержание ДК, МДА, активность АЛТ, АСТ и ЩФ, но не влияет на концентрацию общего билирубина в сыворотке крыс, подвергнутых кровопусканию и не получавших инъекции СЭОМГ. Остальные фракции супернатантов, прилипающих и неприлипающих клеток, не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов после кровопотери. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что иммуномодулирующее действие и метаболические эффекты ГАГ-Р и менадиона опосредуются цитокинами, выделяемыми различными популяциями спленоцитов.

Таблица 5.

Влияние фракций клеток селезенки КПК, получавших инъекции
СЭОМГ, на развитие ГИО у интактных крыс.

Фракции	АОК
Клетки селезенки, не прилипающие к стеклу
Супернатант	50,6±5,2*
Фракция I	23,7±2,8
Фракция II	25,0±3,1
Фракция III	56,3±6,1*
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 4-10ºС
Супернатант	8,6±0,9*
Фракция I	25,6±2,6
Фракция II	8,8±1,1*
Фракция III	24,2±2,8
Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 32-37ºС
Супернатант	64,6±7,2*
Фракция I	23,8±2,9
Фракция II	25,5±2,9
Фракция III	48,5±5,1**
Фракция I + III	47,8±5,2**
Фракция II + III	68,3±7,4***

Примечание:

1)  каждая средняя величина получены в опытах на 8-10 крысах;

2)  в контроле количество АОК 24,7±3,1 тыс./орган, количество РОК 52,6±5,8 тыс./орган;

3)  * - существенность различий относительно контроля;

4)  ** - существенность различий относительно не фракционированного супернатанта;

5)  *** - существенность различий относительно группы фракция I+III.

В качестве препарата сравнения использовали гетерополисахарид животного происхождения – гиалуронат калия. Оказалось, что внутрижелудочное и внутримышечное введение ГК в дозах, соответственно равных 10 мг/кг и 5 мг/кг не оказывало влияния на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.

Отдельное использование ГК и менадиона не оказывает влияния на ФМА ПЯЛ, показатели ГИО и ГЗТ животных после кровопотери. Совместное внутримышечное применение ГК с менадионом не влияет на ФЧ, но повышает ФИ, НСТ-сп. и НСТ-ст. тесты, развитие ГИО и ГЗТ у животных после кровопотери.

Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой, глюкозамином, водо - и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Введение после кровопотери АНК в дозе 1 мг/кг увеличивало показатели ГИО, но не влияло на выраженность ГЗТ. В дозе 2 мг/кг АНК нормализовала развитие ГИО и усиливала, но не нормализовала развитие ГЗТ. ГА в дозе 1 мг/кг не влиял на иммунную реактивность, а в дозе 2 мг/кг – угнетал показатели ГИО и ГЗТ. N-ацетилнейраминовая кислота уменьшала выраженность вызываемого кровопотерей снижения величины метаболических маркеров активности полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов (активности НАДФH-оксидазы и содержания ФДФ) и не влияла на величины маркеров эритроцитов и тромбоцитов (активности Mg2+-АТФазы и содержания МДА). Установлено, что тромбоциты, полученные после кровопотери существенно угнетают активность Mg2+-АТФазы в стромальных частицах эритроцитов интактных животных (активность Mg2+-АТФазы стромы эритроцитов интактных крыс равнялась 0,63±0,08%, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами – 0,40±0,05 мкмоль фосфата на 1г белка в час, р < 0,05). Снижают выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации 11,6±1,3% после инкубации – 7,2±0,8%), не влияя на активность НАДФН-оксидазы ПЯЛ (до инкубации – 1,31 ± 0,19, после инкубации 13,8 ± 0,17 г · моль/мин на 103 клеток) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации – 0,92±0,18, после инкубации 0,78±0,15 пкмоль/106 клеток). Введение АНК после кровопотери не влияло на вызываемое тромбоцитами снижение активности Mg2+-АТФазы стромы эритроцитов интактных животных и ослабляло тромбоцит-зависимое снижение индекса АЗКЦ.

Введение АНК, пиридоксина, фолата или кобаламина здоровым или КПК не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Сочетанное применение АНК с пиридоксином, фолатом вызывало существенное повышение всех показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ, выраженность развития ГИО (но не ГЗТ) на ЭБ. При сочетании АНК с кобаламином величины ФМА ПЯЛ, ГИО и ГЗТ достигали уровня контроля. Введение после кровопотери ретинола ацетата, токоферола ацетата повышало (но не нормализовали) ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность организма в отношении ЭБ. Инъекции АНК не влияли на эффекты, вызываемые токоферола ацетатом, но усиливали иммуномодулирующее действие ретинола ацетата и менадиона (табл. 6).

Таблица 6.

Влияние сочетанного применения N-ацетилнейраминовой кислоты, водо - и жирорастворимых на иммунную реактивность и ФМА нейтрофилов КПК.

№ п/п	Условия опыта	ФАН	ОРН	АОК	РМЛ
1.	Контроль	54,0±5,1	26,4±2,8	27,5±3,0	5,8±0,6
2.	Кровопотеря	14,0±2,1*1	11,2±1,4*1	9,2±1,1*1	2,4±0,2*1
3.	Кровопотеря, введение АНК	13,3±1,5*1	11,7±1,3*1	10,3±1,4*1	2,7±0,3*1
4.	Кровопотеря, введение пиридоксина и АНК	37,2±3,9*1-3	19,4±2,3*1-3	18,6±2,0*1-3	3,9±0,4*1-3
5.	Кровопотеря, введение фолата и АНК	34,±4,1*1-3	18,2±2,1*1-3	20,1±2,3*1-3	4,3±0,4*1-3
6.	Кровопотеря, введение кобаламина и АНК	55,7±5,4*2-5	28,2±3,1*2-5	29,3±3,2*2-5	6,1±0,6*2-5
7.	Кровопотеря, введение ретинола ацетата и АНК	50,2±5,0*2-5	27,3±2,5*2-5	26,8±2,7*2-5	5,4±0,5*2-5
8.	Кровопотеря, введение токоферола ацетата и АНК	35,6±3,4*1-3,6,7	19,0±2,2*1-3,6,7	19,4±2,3*1-3,6,7	3,7±0,4*1-3,6,7
9.	Кровопотеря, введение менадиона и АНК	55,87±5,6*2-5,8	28,3±3,2*2-5,8	27,9±3,2*2-5,8	5,9±0,6*2-5,8

Введение АНК и препаратов витаминов В6 В9 и В12 по отдельности не влияло на показатели окислительно-энергетического статуса и иммунологические свойства легких и тяжелых эритроцитов КПК. Введение АНК в сочетании с пиридоксином, фолатом или кобаламином уменьшало выраженность метаболических изменений эритроцитов и их иммуносупрессирующих свойств, а инъекции АНК с кобаламином, кроме указанного выше индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.

Экстракорпоральное воздействие АНК и кобаламина или АНК и менадиона на эритроциты не индуцировало появление у них иммуномодулирующих свойств. Это дает основание считать, что необходимой предпосылкой появления у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующей активности, служит изменение в организме метаболического состояния эритроцитов, возможно, их энергетического и антиоксидантного потенциала, сопровождающегося возникновением мембранных структур, распознаваемых иммунокомпетентными клетками крови и лимфоидных органов.

Для проверки обоснованности этого представления проведены два варианта экспериментов. В первом КПК, получавшим инъекции кобаламина или менадиона вводили экстракорпорально обработанные АНК тяжелые эритроциты интактных крыс, во втором – КПК, получавшим инъекции АНК, вводили экстракорпорально обработанные кобаламином или менадионом эритроциты здоровых крыс. В первом случае имел место иммуномодулирующий эффект, во втором такой эффект не выявлен. На основании полученных данных можно считать, что кобаламин и менадион в организме КПК сенсибилизируют эритроциты к последующему экстракорпоральному взаимодействию с АНК, приводящему к появлению у эритроцитов иммуностимулирующей активности. В отличие от этого АНК в организме не повышает чувствительности эритроцитов к экстракорпоральному взаимодействию с витаминами.

Можно предположить, что N-ацетилнейраминовая кислота взаимодействует с гликопептидными эпитопами наружной поверхности цитоплазматической мембраны эритроцита. Кобаламин внедряет­ся в фосфолипидную структуру мембраны, а менадион проникает в цитоплазму клетки и активирует белки, регулирующие активность мембранных белков (, , 2003). Вероятно, вызываемые кобаламином и менадионом метаболические эффекты трансформируются в конформационные изменения эпитопов, облегчающие связывание с ними N-ацетилнейраминовой кислоты. Результатом этого, по-видимому, является повышение эффективности взаимодействия эритроцитов с мембранными структурами макрофагов, приводящее к активации их защитных функций.

В качестве препарата сравнения выбран глюкозамин. Введение глюкозамина здоровым или подвергнутым кровопусканию крысам не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Инъекции глюкозамина с витаминами усиливали иммунологические функции после острой кровопотери. Наиболее выраженным было иммуномодулирующее действие глюкозамина с кобаламином, однако, даже в случае введения этих препаратов, параметры иммунологических функций не нормализовались полностью.

Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и после кровопотери. Введение здоровым животным препарата гиалуроновой кислоты вызывает слабо выраженный иммуносупрессирующий эффект. В отличие от этого, продукты частичного гидролиза гликозаминогликанов стимулируют индуцированную фитогемагглютинином бласттрансформацию лимфоцитов и выделение ими хелперных цитокинов, усиливают развитие гуморальной и клеточной форм иммунного ответа (, , 1995). Фрагментация гликозаминогликанов осуществляется набором ферментов, важнейшим из которых является гиалуронидаза. Установлено, что введение гиалуронидазы повышало ФМА полинуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в норме и не влияло на указанные параметры после кровопотери. Изучение влияния гиалуронидазы на иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов показало, что введение гиалуронидазы с РА, ТА или менадионом приводило к выраженному повышению фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов и иммунологической реактивности у здоровых крыс. Инъекции гиалуронидазы или жирорастворимых витаминов по отдельности не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Введение гиалуронидазы с РА или менадионом индуцировало появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Инъекции гиалуронидазы с ТА такого эффекта не вызывали (табл. 7).

Таблица 7.

Влияние гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов
на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.

Показатели	1	2	3	4	5
Контроль	Кровопотеря	Введение Г и РА	Введение Г и ТА	Введение Г и менадиона
АОК	26,4±2,8	9,6±1,3*1	67,2±7,1*1,2	59,3±6,4*1-3	63,7±6,8*1,2
РМЛ	4,5±0,5	2,3±0,2*1	7,4±0,8*1,2	6,9±0,7*1,2	7,2±0,7*1,2
ФЧ	47,1±3,8	25,4±2,3*1	85,0±7,6*1,2	79,4±7,6*1,2	83,5±7,9*1,2
ФИ	1,5±0,1	0,6±0,1*1	4,0±0,4*1,2	3,6±0,4*1,2	3,9±0,4*1,2
НСТ-сп.	13,2±0,9	6,8±0,6*1	14,3±1,1*2	27,5±2,9*1-3	28,4±6,0*1-3
НСТ-ст.	35,3±1,9	21,3±1,8*1	52,4±3,7*1,2	56,0±2,7*1,2	58,4±3,1*1,2

Установлено, что введение интактным крысам ЭКПГ не влияло на активность полинуклеаров и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции ЭКПГ животным, получавшим РА, ТА или менадион, повышали активность полинуклеаров и стимулировали развитие иммунного ответа в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПГ. Наиболее выраженное усиление ГИО и ГЗТ имело место при введении ЭКПГ крысам, которым вводили менадион.