Значение показателей процессов пероксидации липидов, иммунологических маркеров воспаления в диагностике бронхиальной астмы у детей раннего возраста (стр. 3 )

Диагноз бронхиальной астмы основывался на совокупности клинического наблюдения и обследования больных с учетом генеалогического анамнеза, преморбидного фона, лабораторных, иммунологических исследований и рентгенографии органов дыхания, проведенной с целью дифференциальной диагностики. В работе за основу взята классификация БА, представленная в Национальной программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» (2012г). Под наблюдение в работе взяты дети раннего возраста с диагнозом БА, обострение которой связано с ОРИ. При определении степени тяжести заболевания учитывали степень тяжести приступа, наличие или отсутствие ночных приступов, переносимость физической нагрузки.

Обоснование диагноза обструктивного бронхита проводилось с учетом клинического симптомокомплекса, лабораторного и рентгенологического обследования пациентов, генеалогического анамнеза и преморбидного фона. В работе за основу взята классификация клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей Российского респираторного общества, принятой в 2009г.

Под аллергической предрасположенностью у пациентов 3 группы мы понимали неполный аллергологический анамнез, включающий либо наличие наследственной атопии у кровных родственников ребенка, либо наличие острых аллергических реакций на специфические агенты (чаще пищевые аллергены или медикаменты).

На каждого обследованного ребенка была составлена информационная карта, где тщательно были собраны анамнестические сведения о родителях, течение беременности и родов матери, наследственный и аллергический анамнез, клиническое состояние ребенка, данные лабораторных, инструментальных (рентгенография органов грудной клетки, электрокардиография, эхокардиография, пульсоксиметрия), иммунологических методов исследования и проведенной терапии.

Клиническое наблюдение, функциональные и лабораторные исследования проводились в острую фазу заболеваний в первые сутки поступления в стационар (на 2-3 сутки заболевания).

Лабораторные и инструментальные методы исследования у наблюдаемых детей для постановки диагноза представлены в следующем объеме:

− общий анализ крови и мочи, кал на яйца глистов;

− рентгенография органов грудной клетки проводилась у больных детей во всех группах − 100%.

− электрокардиографическое и ЭХО крадиографическое исследования проводились с целью дифференциальной диагностики этиологии БОС в 100%;

− пульсоксиметрия для определения сатурации и тяжести БОС в 100%.

Специальные биохимические методы исследования

Наряду с общеклиническими анализами в соответствии с поставленной целью и задачами проведены специальные исследования. Специальные исследования проведены в биохимической лаборатории ТюмГМА заведующий ЦНИЛ к. м.н. доцент ; старший научный сотрудник, к. б.н. . Иммунологические исследования проводились в отделе клинической иммунологии, клинико – диагностической лаборатории ГБУЗ ТО «Перинатальный центр», г. Тюмени (зав. лаборатории ).

Краткая характеристика специальных методов исследования

1.Уровень интерлейкинов (IL)− IL 2 и IL 10 определяли в сыворотке крови. Определение уровня интерлейкина 2, интерлейкина 10 в сыворотке крови больных детей проводили с использованием наборов реагентов «Вектор-Бест» (IL 2 − ИФА-Бест, IL 10 – ИФА - Бест), разработанных Бест» (Новосибирск), методом твердофазного иммуноферментного анализа, с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента, согласно прилагаемым инструкциям. Специфическими реагентами набора являются моноклональные антитела к анализируемым интерлейкинам. Содержание интерлейкинов выражали в пг/мл, (норма IL 2 составляет 12,35±0,4; IL 10 составляет 1,12 ±0,03).

2. Определение активности холинэстеразы (ХЭ) сыворотки крови (КФ 3.1.1.8). Данный фермент катализирует гидролиз ацетилхолина, и его активность может определенным образом влиять на вегетативный дисбаланс в бронхолегочной системе. Определение активности ХЭ выполнено с помощью кинетического колориметрического теста согласно рекомендациям

DGKC, используя наборы реактивов фирмы «SENTINEL» (Италия). Активность фермента выражена в международных Е/л; референтные пределы активности фермента, обозначенные в инструкции к набору, составляют у мужчин −5100−11700, у женщин – 4000 – 12600 Е/л. По данным [54] у здоровых детей до 6 месяцев активность холинэстеразы может быть на 40 − 50 % ниже, чем у взрослых, то есть от 2500 до 5850 Е/л.

3.Определение β – адренергическую активность мембран эритроцитов (β −АРМ) оценивали в цельной крови [108]. Фотометрической метод данных авторов основан на изменении осмотической резистентности клеток под влиянием β – адреноблокатора. Регистрируется торможение гемолиза эритроцитов, помещенных в гипоосмотическую среду, в присутствии β – адреноблокатора. Результаты выражают в условных единицах торможения (усл. ед). Нормальные величины показателя адренореактивности (β −АРМ) у практически здоровых лиц находятся в диапазоне от 2,0 до 20,0 усл. Ед., что отражает повышение осморезистентности эритроцитов в результате связывания адреноблокатора с β – адренорецепторами.

При сниженной адренореактивности количество β − адренорецепторов на мембранах эритроцитов снижено (десенситизация), связывание адреноблокатора уменьшается и осморезистентность эритроцитов повышается в меньшей степени. В соответствии с условиями метода определения величины β − АРМ при этом превышают 20 усл. ед. Для выполнения анализа использовались наборы реагентов « БЕТА − АРМ − АГАТ» (Москва).

4.Определение продуктов пероксидации эритроцитов проведено спектрофотометрическим методом с сотр.,(1989) в модификации. Особенностью данного метода является то, что после экстракции липидов смесью гептан – изопропанол содержание липопероксидов определяют отдельно в гептановой и изопропанольной фазах экстракта на длинах волн 220, 232, 278 и 420 нм. Раздельная регистрация продуктов ПОЛ в гептане и изопропаноле дает возможность более дифференцировано оценивать их содержание по степени насыщенности и окисленности. Это связано с тем, что изопропанолом экстрагируются преимущественно липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты, в том числе те, которые образовались в результате процессов пероксидации, а в гептановой фазе преобладают соединения с насыщенными жирными кислотами. Результаты выражают в единицах оптической плотности – Е.

Анализировались следующие группы веществ: Е220 − вещества с изолированными двойными связами (ИДС), потенциальные продукты ПОЛ; Е232 − диеновые конъюгаты (ДК) – первичные продукты ПОЛ содержащие остатки жирных кислот с сопряженными двойными связами, т. е. метаболически неустойчивые и подвергающиеся дальнейшее пероксидации и разрушению; Е278 – сумма кетодиенов и сопряженных триенов (КД+СТ). Кетодиены метаболически активные вещества, которые содержат кетогруппу и далее разрушаются в цепных реакциях свободнорадикального окисления (СРО). Сопряженные триены так же метаболически очень активные продукты пероксидации и могут так же разрушаться по пути СРО. Но в то время, они являются соединениями необходимыми для синтеза лейкотриенов и простагландинов, т. е их образование является необходимым звеном в формировании защитных реакций. На длине волны 420 нм – Е420 регистрируют шиффовы основания (ШО) – продукты нейтрализации токсичных веществ образующихся в реакциях пероксидации, их классифицируют как шлаки, балласт, подлежащий выведению из организма.

Результаты замеров оптической плотности использовались далее для расчетов индексов окисленности липидных компонентов (ИОЛ) гептановой и изопропанольной фаз: ИОЛГ232, ИОЛГ278, ИОЛИ232, ИОЛИ278. Индексы рассчитывали как отношение содержания продукта ПОЛ к содержанию веществ с изолированными двойными связами (ИДС). Для гептановой связи ИОЛГ232 = Е232/ Е220 и ИОЛГ278= Е278/ Е220. Для изопропанольной фазы ИОЛИ232= Е232/ Е220 и ИОЛИ278= Е278/ Е220

Раздельная регистрация продуктов ПОЛ дает так же возможность оценить степень ненасыщенности (СНН) липидов изопропанольной фазы относительно гептановой на разных длинах волн. СНН220= Е220И / Е220Г; СНН232= Е232И / Е232Г; СНН278= Е278И / Е278Г [45 ,113].

5.Способность к антирадикальной и антиперекисной защите красных клеток крови оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (Кат). Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.1) катализирует реакцию дисмутации двух молекул супероксиданионрадикала до относительно менее реакционных метаболитов – молекулярного кислорода и перекиси водорода. Принцип метода определения активности СОД [18] основан на ингибировании процесса восстановления нитросинего тетразолия в фотохимической системе рибофлавин − свет –N-N-N-N- тетра-этилендиамин – кислород в присутсвии ферментного препарата. Активность фермента оценивают по степени торможения реакции восстановления −% торможения.

Каталаза (перекись водорода – оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) катализирут разрушение перекиси водорода до воды и молекулярного кислорода. Принцип метода определения активности фермента [148] основан на способности каталазы, разрушать перекись водорода: изменение концентрации последней в среде инкубации регистрируется спектрофотометрически на длине волны 220нм. Активность фермента выражена в млмоль/ мл/ мин.

6.Определение содержания фосфолипидов (ФЛ) в эритроцитах осуществляли в 3 этапа. Первый этап заключался в экстракции липидов из гемолизата эритроцитов смесью флороформ – метанол 2:1 (по Фолчу −Блюру) и упаривания полученного экстракта до сухого остатка. На втором этапе из полученного экстракта методом тонкослойной хроматографии на силикагеле выделяли отдельные фракции ФЛ [53] На пластинах ФЛ идентифицировали по стандартам (фосфатидилхолин, лизофосфатидилхолин), а так же по величинам Rf. Выделяли и далее анализировали 5 основных фракций: фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфатидилхолин (ФХ), сфингомиелин (СФМ), фосфатидилсерин (ФС), лизофосфатидилхолин (ЛФХ). На третьем этапе проводили количественное определение каждой фракции ФЛ: после элюирования и сжигания органической части в муфельной печи в полученном остатке определяли неорганический фосфор (PH) по методу [33]. Результаты выражали млмоль/л PH. Суммировав выделенные компоненты, определяли общие ФЛ и рассчитывали процентные соотношения между фракциями. Конечные результаты выражали в процентах от общего содержания фосфолипидов.

Анализировали также легкоокисляемые (ЛОФ) и трудноокисляемые (ТОФ) фосфолипиды: к группе ЛОФ относят ФЭА и ФС, ТОФ – ФХ и СФМ. Проведен анализ величины окисляемости липидов (ВОЛ), которая рассчитывается как соотношения ТОФ/ ЛОФ [41].

Статистические методы исследования

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере Intel Соге 2с помощью пакета программ Excel, STATISTIKA 7.0 и BIOSTATISTICA 4.03. Определялись основные характеристики: среднее значение вариационного ряда (М) и стандартное отклонение (SD). В зависимости от вида распределения переменные представлены в виде M±SD. Достоверность различий при нормальном распределении оценивали с использованием t – критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05, тем самым минимальная достоверность различий составила 95%. Корреляционный анализ проводился с использованием программы Logistic Regression SPSS. Для выявления корреляционной зависимости вычислялся ранговый коэффициент Спирмена (r). Силу связи оценивали следующим образом:

От -0,25 до -0,25 – как отсутствие связи, или слабую связь

От –0,26 до -0,5 или 0,26 до 0,5 – как умеренную

От –0,5 до -0,75 или от 0,5 до 0,75 – как среднюю

Более 0,75 или –0,75 – как сильную.

Для построения математической модели прогноза формирования БА были вычислены постоянные коэффициенты, зависимые и независимые от аллергоанамнеза и константы биохимических и иммунологических показателей исследуемых детей раннего возраста с ООБ, ООБ с аллергической предрасположенностью и БА (исследование проведено под руководством доцента кафедры «Моделирования и управления», к. т.н. ФГБОУ ВПО «ТюмГНГУ). Верификация каждой модели проводилась путем сравнения реальных (фактических) предложенных иммунологических и биохимических показателей с полученными долженствующими показателями.

2.2. КЛИНИЧЕСКАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

НАБЛЮДАЕМЫХ ДЕТЕЙ

2.2.1 Клинико − лабораторная характеристика детей с

острым бронхитом

Среди обследованных детей с диагнозом острый бронхит наблюдалось 15 детей, из них мальчиков − 11 (0,74), девочек – 4 (0,26). Возрастная структура больных представлена в табл. 3

Таблица 3

Характеристика наблюдаемых больных по возрасту

Анализируемый признак	Количество детей
Возраст детей
6−12мес. 13−24мес. 25 мес.−3 лет.	9 (0,6) 1 (0,06) 5 (0,33)
всего	15

По результатам нашего исследования видно, что наиболее часто болели острым бронхитом дети до 1 года, преимущественно мальчики, что соответствует данным литературы [5, 20].

В семейном анамнезе детей с острым бронхитом преобладала патология ЖКТ 5 (0,33).

В результате анализа акушерско − гинекологического анамнеза отмечено неблагоприятное течение беременности у 12 (0,8) матерей данной группы пациентов осложненное гестозом 1−й и 2−й половины беременности различной степени тяжести. Кроме того, у 4 (0,26) матерей беременность протекала с угрозой выкидыша.

Роды у 12 (0,8) матерей срочные, у 3(0,2) − плановые оперативные (кесарево сечение). Слабость родовой деятельности отмечалась у 4 (0,26) матерей, с медикаментозной стимуляцией. На естественном вскармливании находилось 5 (0,34) детей. На искусственном вскармливании адаптированными молочными смесями («Нутрилон», Нан», «Малютка истринская») у 10 (0,66) детей.

Из анамнеза жизни и анализа историй развития у детей с острым бронхитом были выявлены следующие сопутствующие заболевания и фоновые состояния, которые представлены в табл.4.

Таблице 4

Сопутствующие и перенесенные заболевания

у обследованных детей

Анализируемые признаки	Абсолютная и относительная частота анализируемых признаков
1.последствия ППЦНС − гипертенз. синдром	3 (0,02)
2.Частые ОРИ	25 (0,73)
3. Воздушно-капельные инфекции (корь, краснуха, ветр. оспа, скарлатина, коклюш)	2 (0,13)
4.Реакция на: −аллергия на лекарственные препараты	2 (0,13)
− пищевая аллергия	3 (0,02)
5.Вскармливание: − естественное −искусственное	5 (0,34) 10 (0,66)

Исходя из представленных данных в табл. 4, у обследованных детей в анамнезе преобладают острые респираторные инфекции (0,73).

Начало заболевания у детей с острым бронхитом было острым у всех 15 (1,0) детей. При поступлении на стационарное лечение, жалобы были на повышение температуры до субфебрильных цифр у 2 (0,13) детей, до фебрильных цифр − у 13 (0,86) детей. Жалобы на частый малопродуктивный кашель − у 8 (0,53) детей, влажный кашель – у 7 (0,46) детей, насморк – у 10 (0,66) детей, гнойное выделение из глаз (конъюнктивит) – у 1 (0,06) ребенка, вялость – у 6 (0,4) детей.

У всех 15 детей (1,0) состояние оценивалось средней степени тяжести. Интоксикация отмечалась у 10 (0,66) детей, снижение аппетита у 10 (0,66) детей. Длительность температурной реакции до 1 дня − у 2 (0,13) детей, до 2−х дней – у 6 (0,53) детей, до 3−х дней – у 2−х (0,13) детей.

При осмотре детей с острым бронхитом отмечены умеренные симптомы интоксикации: бледность кожных покровов у 12 (0,8) детей, параорбитальный цианоз у 4 (0,26) детей, сухость кожных покровов – у 1 (0,06) ребенка.

Катаральные проявления в виде слизистого и серозного отделяемого из носовых ходов у 4 (0,26) детей, слизисто − гнойное отделяемое из носовых ходов – у 5 (0,33) детей, затрудненное носовое дыхание – у 10 (0,66) детей, разлитая гиперемия зева, зернистость задней стенки глотки − у 11 (0,73) детей.

Клиническая картина острого бронхита характеризовалась наличием малопродуктивного сухого кашля – у 12 (0,8) детей, влажного кашля у 3−х (0,2) детей. Перкуторно над легкими определялся легочный звук – у 15 (1,0) детей. При аускультации выслушивались у всех детей в данной группе жесткое дыхание и влажные разнокалиберные хрипы проводного характера. Частота дыхания в пределах возрастной нормы – у15 (1,0) детей. Частота сердечных сокращений, превышающая возрастную норму у 5 (0,33) детей. Сатурация кислорода в крови (SaO2) составила от 96% у всех детей данной группы.

При рентгенологическом исследовании органов грудной клетки отмечалось отсутствие инфильтрации легочной ткани и неструктурность корней легких у всех наблюдаемых детей с острым бронхитом.

При исследовании показателей периферической крови у больных с ОБ были получены следующие результаты.

Данные представлены в табл. 5. В ОАК у детей с острым бронхитом лейкоцитоз наблюдался только у одного больного, у 10 (0,66) детей выявлен лимфоцитоз, увеличение СОЭ у 4 (0,26) детей, проявления анемии легкой степени тяжести - у 5 (0,33) детей. Таким образом, изменения в АОК характерны для ОРИ. В ОАМ у всех детей данной группы патологии не было выявлено.

Таблица 5

Морфологические показатели периферической крови

у детей с острым бронхитом

Анализируемые показатели периферической крови	Частота изменений показателей крови у детей
1.Уменьшение числа эритроцитов до 3,4 х 1012/л	5 (0,33)
2. Снижение цветового показателя до 0,7−0,8	1 (0,06)
3. Hb 90г/л−110г/л	4 (0,26)
4. Лейкоцитоз до 11,2х10х9	1 (0,06)
5. Эозинофилия выше 5%	1 (0,06)
6. Анэозинофилия	2 (0,13)
7. Лимфоцитоз	10 (0,66)
8.Увеличение СОЭ до 20 мм/ч	4 (0,26)

На основании анализа анамнеза заболевания, лабораторных и рентгенологических данных у наблюдаемых детей поставлен диагноз острый бронхит в соответствие с классификацией клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей. (Российское респираторное общество, 2009). В анамнезе детей с острым бронхитом выявлены следующие особенности: неблагоприятное течение антенатального и интранатального периода, а также высокий процент исскуственного вскармливания, что видимо, повлияло на высокую частоту респираторной инфекции в раннем возрасте.

На фоне проводимой этиотропной и симптоматической терапии клинические проявления у детей с острым бронхитом уменьшились на 5−7 день у 10 (0,66) детей, на 8−10 день у 5 (0,33) детей. Все дети 15(1,0) были выписаны с улучшением и продолжали лечение амбулаторно в поликлинических условиях согласно рекомендациям для участкового врача.

2.2.2. Клинико − лабораторная характеристика детей с острым

обструктивным бронхитом (1−2 эпизода бронхообструкции)

Среди обследованных детей с диагнозом острый обструктивный бронхит наблюдалось 24 ребенка, из них мальчиков – 17 (0,70), девочек − 7 (0,29). Возрастная структура больных представлена в табл. 6.

Таблица 6

Характеристика наблюдаемых больных по возрасту

Анализируемый признак	ООБ(1−2 эпизода бронхообструкции)
Возраст детей
6 – 12 мес 13 – 24 мес 25 мес. – 3 лет	16 (0,67) 3 (0,12) 5 (0,21)
Всего	24

По результатам нашего исследования видно, что чаще болеют дети до 1 года, преимущественно – мальчики, что соответствует данным литературы [47, 52, 107].

Семейный анамнез, собранный у детей данной группы представлен в табл. 7.

Таблица 7

Семейный анамнез детей с острым обструктивным бронхитом

(1−2 эпизода бронхообструкции)

Анализируемые показатели	Абсолютная и относительная частота анализируемого признака
По линии матери	По линии отца
Эндокринные заболевания	3 (0,12)	2 (0,08)*
Заболевания ЖКТ	3 (0,12)	4 (0,16)*
Заболевания ССС	1 (0,04)	2 (0,08)*
Заболевания мочевыделительной системы	2 (0,08)	2 (0,08)*

* достоверность различий для всех анализируемых показателей - р>0,05

Полученные результаты подтверждают отсутствие наследственной отягощенности аллергическими заболеваниями, а наиболее часто как по линии матери, так и по линии отца встречается патология ЖКТ у 7 (0,28) детей.

Особенности пренатального, интранатального и раннего неонатального периодов представлены в табл. 8

Таблица 8

Общая характеристика пренатального, интранатального и раннего неонатального периодов у больных с обструктивным бронхитом

(1−2 эпизода бронхообструкции)

Анализируемые признаки	Абсолютная и относительная частота анализируемых признаков у больных
1. Беременность: -третья и более	10 (0,41)
2. Рождение от патологически протекавшей беременности §  Гестоз I половины	9 (0,37)
§  Гестоз II половины	7 (0,29)
§  Угроза выкидыша	5 (0,20)
§  ОРИ	4 (0,16)
§  Анемия	1 (0,04)
§  ГБ	1 (0,04)
§  Пиелонефрит	2 (0,08)
§  ЦМВ, ВПГ	1 (0,04)
§  Гипотиреоз	1 (0,04)
3.Нарушение биомеханизмов родов 1  Стимуляция	9 (0,37)
2  Кесарево сечение	7 (0,29)
4.Масса тела при рождении: -меньше 2,6кг -4,1 кг и более	3 (0,12) 1 (0,04)

По данным акушерско − гинекологического анамнеза у 21 (0,86) матери прослеживалось неблагоприятное течение беременности: гестозы 1-й и 2-й половины различной степени тяжести, и угроза выкидыша. У 5(0,20) матерей беременность протекала на фоне хронической сопутствующей патологией. ОРИ во время беременности, перенесли 4 (0,16) матери.