Глава IV. Механизмы формирования патологии (стр. 3 )

,

ГОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия Росздрава», Кемерово

Введение. Грибковые инфекции за последние десятилетия стали важной проблемой здравоохранения во многих странах мира. Внедрение в клиническую практику новых медицинских технологий, пандемия ВИЧ-инфекции и успехи в лечении бактериальных осложнений привели к увеличению популяции иммунокомпрометированных пациентов с высоким риском развития микозов. Быстро увеличивается спектр возбудителей микозов, резистентных к противогрибковым препаратам. Наиболее часто встречающимся заболеванием на фоне сниженного иммунитета является кандидоз, в развитии которого могут принимать участие долее 20 видов грибов рода Candida. Они имеют различие не только по морфологическим и биохимическим свойствам, особенности лабораторных способов выделения и диагностики, а также различную чувствительность к современным пртивогрибковым препаратам. В связи с этим своевременное выявление грибковой инфекции и идентификация возбудителя, а также определение его чувствительности к антимикотикам является обязательными условиями успешного лечения пациентов.

Цель исследования: определение структуры бактериально-грибковых ассоциаций кишечника у ВИЧ-инфицированных детей, а также изучение влияния условно-патогенных бактерий на антимикотическую активность дрожжевых грибов.

Материалы и методы. Изучены бактериально-грибковые ассоциации кишечной микрофлоры у 15 ВИЧ-инфицированных детей, средний возраст которых составил 1,3+0,2 года. Идентификацию грибов и бактерий проводилось с использованием коммерческих тест систем AUXOCOLOR (BioRad, Франция), ANAERO-TEST 23 (Lachema, Чехия), STAPHY-TEST 16 (Lachema, Чехия), STREPTO-TEST 16 (Lachema, Чехия), СИБ для энтеробактерий набор № 2 (НПО «Микроген», Нижний-Новгород. Количество микроорганизмов определяли как логарифм числа колониеобразующих единиц в 1мл отделяемого (КОЕ/г). Чувствительность к антимикотикам определяли с помощью диско-диффузионного метода.

Полученные результаты были обработаны с помощью компьютерной программы STATISTICA 6,0.

Результаты исследования. В результате проведенных исследований установлено, что подавляющее большинство штаммов дрожжевых грибов, выделенных из кишечника ВИЧ-инфицированных детей, относится к виду Candida albicans - 61,1%, на долю non-albicans-видов приходится 38,9%. При этом, 86,4% C. albicans выделялись в ассоциации с тремя представителями условно-патогенной флоры: золотистым стафилококком - в 77,8%, клебсиеллами – в 66,7% и кишечной палочкой с измененными биологическими свойствами (не ферментирующие лактозу – Lac- и обладающие гемолизинпродуцирующей активностью Hly+) – в 55,5% случаев. Non-albicans-виды у 30,8% обследованных детей высевались в аналогичных бактериальных взаимоотношениях, однако доминирующее положение занимала ассоциация с клебсиеллой (100% случаев), в половине случаев с данными микромицетами выделялись золотистый стафилококк и протей, тогда как E. coli Lac-, Hly+ при обнаружении грибов non-albicans-видов встречалась лишь у четверти детей. Установлено, что чувствительность к антимикотикам C. albicans и non-albicans-видов в наиболее распространенных ассоциациях с УПМ различна. Так, C. albicans, выделенные совместно с E. coli Lac-, Hly+ и Staphylococcus aureus, проявляли более высокую чувствительность, по сравнению с non-albicans-видами, к нистатину (100% и 78,5%) и амфотерицину В (100% и 83,3%) (р<0,05), чувствительность же к клотримазолу была высокой как у C. albicans, так и у non-albicans-видов, составившая 90-100% соответственно. Чувствительность к флуконазолу у C. albicans была выше в ассоциации с золотистым стафилококком (50%), тогда как non-albicans-виды, выделенные совместно с Staphylococcus aureus, в 100% случаев проявляли резистентность к данному антимикотику (р<0,01). Низкая чувствительность к флюконазолу зарегистрирована у микромицетов, обнаруженных с E. coli Lac-, Hly+ , составившая у non-albicans-видов 25% и у С. аlbicans - 18%. Чувствительность ко всем антимикотикам у C. albicans в ассоциации с клебсиеллой, была выше, чем у non-albicans-видов. Так, к нистатину и клотримазолу она составила по 100%, а у non-albicans-видов - 100% и 87,5% соответственно, к амфотерицину В – 88,9% (против 50% у non-albicans-видов), к флуконазолу – 66,7% (у non-albicans-видов – 25%) (р<0,05).

Заключение. Выделение грибов из кишечного биотопа у ВИЧ-инфицированных детей сопровождается наличием условно-патогенных бактерий, среди которых ведущими являются гемолитические, лактозонегативные кишечные палочки, клебсиеллы и золотистый стафилококк. Формирование бактериально-грибковых патобиоценозов в условиях иммуносупрессии способствует изменению чувствительности микромицетов к антимикотическим препаратам. Для оптимизации и повышения эффективности лечения микотических инфекций у ВИЧ-инфицированных детей необходимо проводить идентификацию выделенных УПМ и микромицетов с определением чувствительности к антимикотическим препаратам.

СОСТОЯНИЕ ИММУННОГО СТАТУСА И АКТИВНОСТЬ

НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ЛИМФОЦИТОВ

У БОЛЬНЫХ ДИФФУЗНЫМ ТОКСИЧЕСКИМ ЗОБОМ

В ПРОЦЕССЕ ЛЕЧЕНИЯ

, ,

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН,

КГУЗ «Краевая клиническая больница», Красноярск

На сегодняшний день показано, что патогенез диффузного токсического зоба (ДТЗ) тесно связан с нарушениями иммунной системы, а именно со снижением супрессорной активности лимфоцитов, что, в свою очередь, благоприятствует появлению аутоантител. Основную роль в патогенезе ДТЗ принадлежит стимулирующим аутоантителам к рецептору ТТГ тиреоцитов. Результатом стимуляции тиреоцитов является развитие тиреотоксикоза. В процессе тиреоидстатической терапии достигается эутиреоидное состояние, однако супрессорная функция лимфоцитов у больных ДТЗ не восстанавливается до уровня, наблюдаемого в группе практически здоровых лиц. Как известно, в основе функциональных проявлений лимфоцитов лежат их метаболические реакции, особенно высокой информативностью обладают показатели активности окислительно-восстановительных ферментов.

Цель работы: выявить особенности состояния иммунной системы и метаболизма лимфоцитов больных ДТЗ в процессе терапевтического достижения эутиреоидного состояния.

Материалы и методы. В исследование включено 35 женщин с диагнозом ДТЗ. Диагноз устанавливался на основании клинических данных, результатов гормонального анализа, наличия антител к ткани щитовидной железы и ультразвукового обследования железы. Первоначальное обследование проводилось до начала лечения, повторные через 1 и 3 мес. после начала тиреоидсупрессивной терапии.

Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови исследовали методом флуоресцентной микроскопии с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам. Концентрацию общих IgA, IgM, IgG сыворотки крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по G.Mancini (1965). Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке крови оценивали турбидиметрическим методом.

Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах проводили биолюминесцентными методами. Определяли активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), аэробная и анаэробная реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД+- и НАДН-зависимые реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДНМДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАДФ+- и НАДФН-зависимые реакции глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФНГДГ), НАД+- и НАДН-зависимые реакции глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДНГДГ), НАД - и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР).

Результаты. При первичном обследовании больные ДТЗ находятся в состоянии клинического гипертиреоза. Через 1 месяц после начала лечения у пациентов с ДТЗ нормализовалось содержание тиреоидных гормонов, что отражает переход гипертиреоза в субклиническую форму. Еще через месяц все гормональные показатели укладывались в границы нормальных диапазонов, следовательно, достигалось этиреоидное состояние. Однако на протяжении всего периода исследования уровень антител к тиреоидной пероксидазе оставался значительно повышенным.

У больных ДТЗ до начала лечения установлено повышение процентного содержания лимфоцитов в периферической крови и абсолютного количества CD19+-клеток, что приводит к снижению величины лейко-В-клеточного коэффициента. Также обнаружено повышение относительного и абсолютного уровней HLA-DR+-клеток. Повышение содержания В-лимфоцитов в крови выявляется при снижении уровня относительного синтеза IgA. Состояние реактивности гуморального звена иммунной системы у больных женщин также характеризуется повышением концентрации ЦИК в сыворотке крови.

Исследование состояния метаболизма лимфоцитов выявило значительные их особенности при ДТЗ. При первичном исследовании обнаружено повышение уровней активности Г6ФДГ, НАД(Ф)ГДГ, НАД(Ф)НГДГ, НАДНМДГ и ГР при снижении уровня активности НАДФИЦДГ в лимфоцитах. Следовательно, в лимфоцитах женщин с ДТЗ наблюдается усиление макромолекулярного синтеза, интенсификация аминокислотного обмена при увеличении уровня аэробного окисления, показателем которого является усиление перекисных процессов.

Через месяц после начала лечения имеется повышение относительного и абсолютного количества CD4+-лимфоцитов по сравнению с контрольными величинами, при этом увеличенный процентный уровень общих лимфоцитов сохраняется. В этот период лечения абсолютный уровень CD8+-клеток соответствует контрольному значению. Через 3 мес. после начала лечения установлено повышение абсолютного содержания CD3+- и CD8+-лимфоцитов относительно контроля.

Кроме того, через 1 мес. после начала лечения больных ДТЗ обнаружено снижение процентного количества HLA-DR+-клеток относительно значений, выявленных у больных до начала лечения. Через 3 мес. после начала лечения вновь установлено повышение абсолютного содержания CD19+-лимфоцитов, а также относительного и абсолютного количества HLA-DR+-клеток. При изучении состояния гуморального иммунитета у больных ДТЗ установлено, что через 1 мес. после начала лечения при сохранении повышенного содержания ЦИК выявляется повышение концентрации IgG.

Через 3 мес. после начала лечения концентрация IgG достигает максимальных значений (уровень статистически достоверно выше, чем у лиц контрольной группы и больных до начала лечения), также снижается уровень относительного синтеза IgM и опускается величина относительного синтеза IgA по сравнению аналогичным показателем по прошествии 1 мес. терапии.

Исследование метаболизма лимфоцитов крови женщин с ДТЗ показало, что через 1 мес. после начала лечения в лимфоцитах больных ДТЗ повышена активность Г6ФДГ, Г3ФДГ, НАДНМДГ, ГР, прямых и обратных НАД+- и НАДФ+-зависимых глутаматдегидрогеназ, относительно контроля. При обследовании через 2 мес. обнаружены следующие особенности метаболизма лимфоцитов лиц с ДТЗ: увеличена активность Г6ФДГ, ЛДГ, НАДНМДГ, ГР, НАДФГДГ, НАД+- и НАДФ+-, НАДФН-зависимых глутаматдегидрогеназ, относительно контроля. Причем активность ЛДГ – выше, а НАДНГДГ - ниже при последнем исследовании, относительно группы женщин с ДТЗ до лечения.

Кроме того, в лимфоцитах женщин с ДТЗ через 3 мес. после начала лечения обнаружено снижение активности НАДНГДГ, относительно данных исследования как до, так и через 1 мес. после начала лечения.

Заключение. Таким образом, при лечении тиреостатиками в течение первых 3 мес. состояние иммунного статуса неустойчиво, при этом не прослеживается явных тенденций в изменениях величин показателей иммунограммы. При этом не стабильны как показатели клеточного, так и гуморального иммунитета. Данные результаты могут объясняться динамичным состоянием всех функциональных систем организма, ведь за достаточно короткий срок (3 мес.) происходит изменение как гормонального тиреоидного фона, так и регулирующих факторов других гомеостатических систем. В тоже время изменения метаболизма лимфоцитов периферической крови более выражены и определенны. В течение периода терапии больных ДТЗ в лимфоцитах повышен уровень макромолекулярного синтеза и антиоксидантной активности, интенсифицирован малат-аспартатный челнок, а также аминокислотный обмен. Кроме того, активность энергетических процессов в лимфоцитах лиц с ДТЗ нестабильна. Несомненно, что обмен веществ в лимфоцитах крови больных ДТЗ достаточно активен в течение 3-х мес. тиреостатической терапии.

ЗАВИСИМОСТЬ УРОВНЕЙ СИНТЕЗА ИНТЕРФЕРОНА-g

И ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ-a И АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ ОТ СТЕПЕНИ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ

, ,

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск

Целью исследования явилось изучение особенностей активности ферментов в лимфоцитах крови и уровней синтеза интерферона-g (ИФНγ) и фактора некроза опухоли-a (ФНОα) у больных острым вирусным гепатитом В (ОВГВ) в зависимости от степени вирусной нагрузки.

Материалы и методы. Обследовано 76 пациентов инфекционных больниц г. Красноярска с диагнозом «острый вирусный гепатит В, среднетяжелое течение» (31 женщина и 45 мужчин). Диагноз ОВГВ устанавливался при помощи стандартных клинико-биохимических методов и верифицировался обнаружением с помощью иммуноферментных методов специфических маркеров – НBsAg, HBeAg, специфических иммуноглобулинов G и М к HBcAg, общих антител к HbeAg и вирусной ДНК. Из обследования исключались лица, инфицированные другими вирусами гепатитов и вирусом иммунодефицита человека. В качестве контроля обследовано 106 здоровых людей (49 женщин и 57 мужчин).

ДНК вируса гепатита В (ВГВ) выявляли методом полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченых гибридизационных зондов (“ДНК-технология”, Москва). Определение активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови проводили биолюминесцентным методом. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД - и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД - и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ - и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД - и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД - и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ в лимфоцитах крови выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин) на 104 клеток.

Спонтанная и индуцированная продукция интерферона-g (ИФНγ) и фактора некроза опухоли-a (ФНОα) оценивалась иммуноферментным методом с использованием тест-систем производства Вектор-Бест (г. Новосибирск) после in vitro инкубации цельной крови с индуктором синтеза цитокинов фитогемагглютинином (ФГА) и рекомбинантным НВsAg (вакцина HBVax II производства Merk Sharp Doun, США) в СО2-инкубаторе в течение 24 часов.

Результаты. При исследовании особенностей метаболизма лимфоцитов в зависимости от степени вирусной нагрузки обнаружено, что состояние активности НАД - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ значительно различается, формируя метаболический статус, характеризующий реактивность клеток иммунной системы. Кроме того, установлено, что наиболее высокие уровни спонтанного синтеза отмечаются в группе больных с высокой степенью вирусной нагрузкой (достоверное увеличение относительно уровней, выявляемых во всех обследованных группах). В то же время, при низкой и средней степени вирусной нагрузки также выявляется повышение уровня спонтанного синтеза ИФНγ относительно контрольного диапазона. При стимуляции ФГА наиболее интенсивный уровень отмечен в контрольной группе (в 114 раз). При низкой и средней степени вирусной нагрузки уровень ФГА-индуцированого синтеза ИФНγ повышается в 2,7 и 2,6 раза, соответственно. В то же время, у больных с высокой степенью вирусной нагрузки воздействие ФГА на мононуклеарные клетки не приводит к изменению уровня синтеза данного цитокина. При стимуляции HBsAg наиболее интенсивный ответ по синтезу ИФНγ также выявляется у лиц контрольной группы (увеличение в 11,6 раз). У больных ОВГВ с низкой и средней степенью вирусной нагрузки уровень синтеза цитокина при воздействии HBsAg повышается в 1,4 и 1,3 раза, соответственно. При высокой степени вирусной нагрузки выявляется снижение уровня синтеза ИФНγ на 14,6% при воздействии HBsAg. Наиболее высокий уровень спонтанной продукции ФНОα отмечается у больных ОВГВ с низкой степенью вирусной нагрузкой. С повышением степени вирусной нагрузки уровень спонтанного синтеза данного цитокина статистически достоверно снижается. Максимальный уровень повышения синтеза ФНОα при воздействии ФГА выявляется у лиц контрольной группы (в 36,0 раз). В группах больных ОВГВ максимальный уровень повышения синтеза ФНОα в ответ на воздействие ФГА выявляется в группе с высокой степенью вирусной нагрузки (в 9,7 раза), тогда как минимальный (в 2,1 раза) – у больных со средней степенью вирусной нагрузки. Максимальный уровень повышения уровня синтеза ФНОα при воздействии HBsAg также выявляется у лиц контрольной группы (в 16,0 раз). Среди групп больных ОВГВ максимальный уровень повышения синтеза ФНОα при воздействии HBsAg выявляется у больных с низкой степенью вирусной нагрузки (в 4,2 раза), тогда как при средней и высокой степени в ответ на HBsAg выявляется увеличение синтеза данного цитокина в 1,5 и 2,5 раза, соответственно.

Заключение. Таким образом, исследована зависимость уровней активности НАД - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах крови у больных ОВГВ в зависимости от степени вирусной нагрузки. Установлено, что уже при низком уровне содержания вирусной ДНК в сыворотке крови в лимфоцитах крови снижается интенсивность метаболических реакций, определяющих активность анаэробных и аэробных процессов. При средней степени вирусной нагрузки выявляется наиболее выраженное изменение метаболических реакций, определяющих недостаточность энергетических процессов. При высокой степени вирусной нагрузки обнаружено наименьший уровень изменения активности исследуемых дегидрогеназ в лимфоцитах крови. У больных данной группы установлено снижение интенсивности анаэробного окисления глюкозы и повышение оттока субстратов с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена, при относительно увеличении активности ГР. Только при средней и высокой степени вирусной нагрузки выявляется наличие корреляционных взаимосвязей между уровнем содержания вирусной ДНК в сыворотке крови и активностью некоторых из исследуемых оксидоредуктаз лимфоцитов, что отражает увеличение степени недостаточности энергетических и анаболических реакций при высоком уровне содержания ДНК ВГВ. При оценке уровней спонтанного и индуцированного синтеза ИФНγ и ФНОa установлено, что у больных ОВГВ выявляется исходная повышенная активность мононуклеарных клеток к синтезу цитокинов, но при снижении активности мононуклеаров при дополнительной функциональной индукции. При этом выявляется снижение уровня спонтанного синтеза ФНОa с увеличением степени вирусной нагрузки.

ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ ГЕМОСТАЗА И УРОВНЕЙ АКТИВНОСТИ НАД(Ф)-ЗАВИСИМЫХ ДЕГИДРОГЕНАЗ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ КЛАССАХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

, ,

Красноярский государственный медицинский университет,

НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН, Красноярск

Основной причиной развития ишемической болезни сердца (ИБС) является атеросклероз, в патогенезе которого большое значение имеют нарушения в системе гемостаза. Установлено, что у больных ИБС при исследовании показателей гемостаза выявляется гиперфункциональное состояние тромбоцитов и изменения плазменного звена. При этом, данные нарушения значительно ухудшают прогноз заболевания и осложняют лечение. Ключевую роль в системе гемостаза играют тромбоциты. Именно эти клетки создают основу клеточного звена системы гемостаза, а также в тромбоцитах синтезируется ряд ключевых факторов плазменного звена гемостаза, в частности, фибриноген. Клеточная функция во многом определяется состоянием внутриклеточной метаболической системы. В настоящее время известно, что функциональная активность тромбоцитов зависит от рН среды, интенсивности транспорта Са2+, К+ и Na+. В то же время, состояние основных метаболических процессов в тромбоцитах до сих пор не изучено. Целью исследования явилось изучение состояния гемостаза и уровней активности НАД - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах у больных ИБС различных функциональных классов (ФК).

Материалы и методы. Под нашим наблюдением находилась 62 пациента мужского пола со стенокардией II-IV функционального класса в возрасте от 38 до 73 лет. Контрольная группа состояла из 30 доноров. У всех обследованных определялись показатели гемостаза. Изучались показатели сосудисто-тромбоцитарного гемостаза: подсчет числа тромбоцитов, спонтанная и индуцированная агрегация тромбоцитов на агрегометре «Биола» (индукторы: АДФ 5mM, коллаген 20 мг/мл, адреналин 7 мкг/мл), концентрация фактора Виллебранда (ФВ). Показатели коагуляционного гемостаза изучались с помощью следующих показателей: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое отношение (ПО), тромбиновое время (ТВ), концентрация фибриногена (ФГ), уровень растворимых фибринмономерных комплексов (РФМК). Определяли уровень физиологического антикоагулянта антитромбина III (АТ-III). Дополнительно оценивали уровень XIIa-зависимого фибринолиза и уровня плазминогена.

Определение активности НАД - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в тромбоцитах крови проводили с помощью биолюминесцентного метода. Данным методом определялась активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ, КФ 1.1.1.8), малик-фермента (НАДФМДГ, КФ 1.1.1.40), НАД - и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ, КФ 1.1.1.27), НАД - и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ, КФ 1.1.1.37), НАДФ - и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФ-ГДГ и НАДФН-ГДГ, КФ 1.4.1.4), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАД-ГДГ и НАДН-ГДГ, КФ 1.4.1.2), НАД - и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАД-ИЦДГ, КФ 1.1.1.41 и НАДФ-ИЦДГ, КФ 1.1.1.42, соответственно) и глутатионредуктазы (ГР, КФ 1.6.4.2). Активность оксидоредуктаз выражали в мкЕ/мг белка (1 Е=1 мкмоль/мин). Содержание белка определяли по методу Брэдфорда.