Технология получения биологически активных веществ из отходов переработки креветки и применение их в животноводстве (стр. 1 )

На правах рукописи

Технология получения биологически активных веществ из отходов переработки креветки и применение их в животноводстве

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Щелково - 2012

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП) Российской академии сельскохозяйственных наук (РАСХН)

Научный руководитель:	- доктор биологических наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», заведующий отделом получения биологически активных веществ
Официальные оппоненты:	- доктор биологических наук, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности», заведующая лабораторией обеспечения качества вакцин
- доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологи и микробиологии», заведующий лабораторией музейных штаммов
Ведущая организация:	ГНУ «Всероссийский научно - исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. »

Защита диссертации состоится 26 октября 2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 при ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» РАСХН Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината д.17, ВНИТИБП; тел./; e-mail: [e-mail]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии

Автореферат разослан 25 сентября 2012 г.

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Разработка комплексных малоотходных технологий переработки водных биологических ресурсов, в частности промысловых ракообразных, является перспективным направлением современного развития рыбохозяйственного комплекса Российской Федерации. В состав панцирьсодержащих отходов (ПСО) ракообразных входят такие ценные вещества, как хитин и белок, которые могут быть направлены на получение хитозана, глюкозамина и белковых гидролизатов. К сожалению, в настоящее время ПСО чаще всего не используются, при этом теряются их ценные компоненты. В нашей стране до сих пор остается актуальным вопрос дефицита кормового протеина. Белковые гидролизаты, полученные из гидробионтов, обладают высокой питательной ценностью и содержат в своем составе все незаменимые аминокислоты (, 1998; , 2004).

Основным сырьем для получения хитина и хитозана является хитинсодержащее сырье (ХСС), в основном панцирь ракообразных (крабы, креветки, криль). Для выделения хитина и хитозана наиболее широко используется метод кислотно-щелочного удаления сопутствующих белков, липидов и минералов. Существенным недостатком данной технологии является необходимость утилизации сточных вод, а также ограниченное применение белков, выделяемых из панциря. Имеются данные о получении хитина и хитозана с применением ферментных препаратов (, 1988; , 1992; , 1998). Применение ферментов для выделения белковой составляющей панциря позволяет получать гидролизаты с высокой биологической ценностью, однако недостатком данного способа обработки ХСС является высокая стоимость коммерческих ферментных препаратов. В связи с этим использование гомогената поджелудочной железы, содержащей в своем составе комплекс протеолитических ферментов, для переработки ХСС представляется перспективным направлением.

Уникальная структура хитозана обуславливает его широкое применение в биотехнологии, медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве и пищевой промышленности (, 1992; , 1999; Л. А. Hудьга, 2002; Г. А. Вихорева, 2002; , 2004; , 2005; , 2006; R.A.A. Muzzarelli, 1997; M.G. Peter, 1997). Хитозан обладает широким спектром антимикробной активности, в том числе по отношению к патогенной микрофлоре (, 2006; , 2010). Имеются данные о способности хитозана стимулировать рост бифидобактерий и лактобактерий (, 2001; L. Huean-Woo, 2002; W.H. Lee, 2002), что позволяет применять его в комплексе с пробиотическими препаратами. Пребиотические свойства хитозана изучены недостаточно, поэтому оценка симбиотического действия хитозана с различными пробиотическими штаммами микроорганизмов представляет научный и практический интерес.

В связи с вышеизложенным, исследования в области разработки технологии комплексной переработки отходов креветки являются актуальными, имеют научную и практическую значимость.

Цель и задачи исследований. Основной целью исследований является разработка технологии получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата из отходов переработки креветки и применение их в животноводстве.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

- разработать технологию комплексной переработки отходов креветки с применением в качестве ферментсодержащего препарата гомогената поджелудочной железы свиньи;

- оптимизировать технологические параметры процесса получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата, изучить их физико-химические свойства;

- провести доклинические исследования полученных препаратов белкового гидролизата и глюкозамина гидрохлорида;

- изучить влияние сукцината хитозана в комплексе с пробиотическим препаратом «Проваген» на прирост живой массы, биохимические и клинические показатели крови, а также на микробиоценоз кишечника молодняка крупного рогатого скота;

- изучить влияние полученного по разработанной технологии белкового гидролизата в составе пробиотического препарата «Муцинол» на прирост живой массы, биохимические и клинические показатели крови молодняка свиней в период отъема.

Научная новизна исследований. Научно обоснована и разработана технология комплексной переработки отходов креветки с использованием ферментсодержащего гомогената поджелудочной железы свиньи. По разработанной технологии получены биологически активные вещества: хитин, хитозан, а также глюкозамина гидрохлорид и белковый гидролизат, не обладающие токсичностью, раздражающим и аллергизирующим действием.

Показано, что включение в основной рацион молодняка крупного рогатого скота сукцината хитозана в составе пробиотического препарата «Проваген» способствует оптимизации гомеостаза, повышению среднесуточного прироста живой массы, оказывает положительное влияние на микробиоценоз кишечника.

Применение белкового гидролизата в составе пробиотического препарата «Муцинол» способствует повышению живой массы молодняка свиней в период отъема и оптимизации гомеостаза организма.

Практическая значимость работы. Разработана промышленная технология комплексной переработки отходов креветки с применением в качестве ферментсодержащего препарата гомогената поджелудочной железы свиньи, позволяющая получать хитин, хитозан, глюкозамина гидрохлорид и белковый гидролизат.

Результаты исследований апробированы в установленном порядке в производственных условиях Щелковского района МО, пос. Биокомбината.

Показана эффективность включения в состав рациона молодняка крупного рогатого скота сукцината хитозана в комплексе с пробиотическим препаратом «Проваген» и белкового гидролизата в комплексе с пробиотическим препаратом «Муцинол» в состав рациона молодняка свиней.

Основные положения работы, выносимые на защиту.

1. Промышленная технология комплексной переработки отходов креветки.

2. Оптимизация технологических параметров процесса получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата.

3. Доклинические исследования белкового гидролизата и глюкозамина гидрохлорида из отходов креветки.

4. Влияние сукцината хитозана в составе пробиотического препарата «Проваген» на прирост живой массы, биохимические и клинические показатели крови и микробиоценоз кишечника молодняка крупного рогатого скота.

5. Влияние белкового гидролизата из отходов креветки в составе пробиотического препарата «Муцинол» на прирост живой массы, биохимические и клинические показатели крови молодняка свиней.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы проводились совместно с доктором биологических наук, профессором (Брянская ГСХА); доктором ветеринарных наук, профессором (ВИГИС); кандидатом биологических наук (ВНИТИБП); кандидатом химических наук (Центр «Биоинженерия» РАН); кандидатом биологических наук (МНИЦ «ОЗОС»); кандидатом биологических наук ().

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИТИБП (), на Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Нижний Новгород, 2010), Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 2010), Конференции «Инновационные технологии управления здоровьем и долголетием человека» (Санкт Петербург, 2010), Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010), Международной научной конференции «молодежная наука – пищевой промышленности» (Ставрополь, 2011), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология – для здорового питания и решения медико-социальных проблем» (Светлогорск, 2011), Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Южно-Сахалинск,2011), Международной научно-практической конференции «Актуальные аспекты разработки, приготовления, контроля качества и использования ветеринарных иммунобиологических препаратов на основе современных биотехнологий» (Алушта, АР Крым, 2011), the 10th International Conference of the European Chitin Society (St.-Petetersburg, 2011), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» - (Покров, 2012), Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Мурманск, 2012), заседании секции «Ветеринарная биотехнология» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Щелково, 2012), на совещаниях сотрудников отдела биологически активных веществ ГНУ ВНИТИБП ().

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы 23 научные работы, в том числе 5 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы, практические предложения. Диссертация иллюстрирована 31 таблицей и 8 рисунками. Список литературы включает 243 источника, из которых 120 отечественных и 123 иностранных. В приложениях представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

2 Собственные исследования

Работа выполнена в гг. в отделе получения биологически активных веществ ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития АПК РФ, задание 08.06.02 «Научно обосновать, разработать и освоить производство новых видов лекарственных средств на основе сырья природного происхождения и микробиологического синтеза, повышающих иммунитет, продуктивность животных, качество и экологическую безопасность продукции животноводства».

Материалы и методы

Исходным сырьем для получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата были выбраны отходы креветки (ТУ 7). В качестве ферментсодержащего препарата использовали гомогенизированную на коллоидной мельнице поджелудочную железу свиньи (ГОСТ ). Протеолитическую активность гомогената поджелудочной железы свиньи определяли методом Ансона (, , 1981).

Разработку и оптимизацию основных режимов технологии получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата осуществляли в экспериментально-производственных условиях. Гидролиз исходного сырья проводили в реакторе емкостью 250 л, высушивание гидролизата осуществляли на распылительной сушке NIRO - ATOMIZER.

При разработке технологии получения хитина, хитозана, глюкозамина гидрохлорида и белкового гидролизата изучали оптимальные условия проведения ферментативного гидролиза (концентрация ферментного препарата, время, температура, соотношение субстрат:вода), процесса депротеинирования ХСС (концентрация щелочи, соотношение субстрат:вода, время, температура), деминерализации ХСС (концентрация кислоты, время, температура, соотношение субстрат:вода), кислотного гидролиза хитина (температура, время, соотношение хитин:кислота).

Степень деацетилирования (СД) хитозана определяли методом кондуктометрического титрования (L. Raymond, et al., 1993). Средневесовую молекулярную массу, среднечисловую массу и значение полидисперсности образцов хитозана определяли методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе «Sykam» (Германия). Глубину гидролиза оценивали по накоплению свободных аминогрупп (аминный азот) в жидком гидролизате. Количество белка в препаратах хитина определяли по биуретовой реакции (A.G. Gornall, et al., 1949), содержание золы и воды в хитозане, концентрацию аминогрупп в белковом гидролизате - по ГОСТ 7636-85.

Доклинические исследования белкового гидролизата и глюкозамина гидрохлорида проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического Государственного комитета «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (Москва, 2005) на базе аккредитованной испытательной лаборатории и вивария МНИЦ «ОЗОС» при ГНУ ВИГИС им. .

Эффективность применения пробиотического препарата «Проваген» производства центр» (ТУ ) и его комплекса с сукцинатом хитозана (ТУ ) оценивали на телятах швицкой породы 2-3 - недельного возраста в СПК "Ильинск" Смоленской области. Препарат «Проваген» применяли согласно рекомендациям предприятия-изготовителя.

С учетом живой массы и интенсивности роста методом парных аналогов были сформированы 3 группы телят по 10 голов в каждой: I-ая группа-контрольная, II-ая и III-я - опытные. Животные всех групп получали основной рацион, принятый в хозяйстве. Телятам II-ой группы ежедневно в течение 7 суток давали пробиотик «Проваген» (14 г/голову) содержащий в своем составе пробиотические штаммы Bacillus licheniformis ВКМ В-2414 и Bacillus subtilis ВКМ В-2287 , животным III-ей группы - комплекс этого пробиотика (14 г/голову) с сукцинатом хитозана (1,6 г/голову). Дневную дозу препаратов выпаивали вместе с молоком во время утреннего и вечернего кормления. За животными вели наблюдение в течение 10 недель с начала опыта. Через 5 суток после окончания опыта у животных брали содержимое кишечника для микробиологического анализа. Пробы крови для биохимического и клинического анализа получали утром до кормления из яремной вены перед началом опыта и через 10 суток после его окончания.

Влияние белкового гидролизата в составе пробиотического препарата «Муцинол» производства Фарм» (ТУ ) на прирост живой массы, клинические и биохимические показатели крови молодняка свиней изучали в условиях свинокомплекса группа РОСТ» Московской области.

С учетом живой массы и интенсивности роста методом парных аналогов были сформированы 3 опытные группы поросят крупной белой породы 4-недельного возраста по 10 голов в каждой. Животные I-ой контрольной группы получали общий рацион, принятый в хозяйстве. Поросята II-ой группы в дополнение к основному рациону в течение 10 дней получали препарат «Муцинол», содержащий в своем составе споры Bacillus subtilis ВКМ В-2716D и Bacillus licheniformis ВКМ В-2717D в концентрации не менее 1×109 КОЕ/г и хитозан с молекулярной массой 500 кДа в дозе 5 г/голову. Животным III-ей группы в течение 10 дней скармливали препарат «Муцинол» (5 г/ голову) и гидролизат из отходов креветки в дозе 1г/кг живой массы. За животными вели наблюдение в течение 6 недель с начала опыта. Пробиотический препарат «Муцинол» применяли согласно рекомендациям предприятия-изготовителя.