Клинико-диагностическое значение определения антител к аденозиндезаминазе у больных ревматоидным артритом с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемого сорбента (стр. 2 )

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 168 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, обсуждения результатов, выводов и практических рекомендаций. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 11 рисунками, 3 выписками из истории болезни. Библиографический указатель содержит 272 источника, в том числе 92 на русском языке и 180 на иностранных языках.

Материалы и методы исследований

Под наблюдением находились 142 больных с достоверным РА по критериям Американской коллегии ревматологов, 48 больных ОА и 30 практически здоровых лиц в возрасте от 24 до 46 лет (19 женщин и 11 мужчин) - доноров станции переливания крови, прошедших обычное обследование.

Больные ревматоидным артритом

Среди обследованных больных РА было 100 (70,4%) женщин и 42 (29,6%) мужчины. Средний возраст больных – 46,8 ± 3,2 года. Инвалидность по основному заболеванию (РА) установлена у 44 (40,8%) больных. Степень активности патологического процесса определялась в соответствии с диагностическими критериями, рабочей классификацией РА и индексом DAS28 (Disease Activity Score), рекомендованным EULAR. I-ая (минимальная) степень установлена у 34 (24%), II (умеренная) — у 88 (62%) и III (максимальная) — у 20 (14%) больных. Взаимосвязь активности РА и возраста больных представлена в таблице 1.

Таблица 1

Возраст больных и активность ревматоидного процесса

Степень активности	N	Возраст (лет)
< 20	21-30	31-40	41-50	> 50
I	34	-	2 (6%)	10(29,5%)	14 (41%)	8 (23,5%)
II	88	4 (5%)	4 (5%)	24 (27%)	46 (52%)	10 (11%)
III	20	-	2 (10%)	10 (50%)	8 (40%)	-
Всего	142	4 (3%)	8 (5,5%)	44 (31%)	68 (48%)	18(12,5%)

Основной контингент больных РА был в возрасте 31-50 лет (78,9%), причем при I и II степенях активности ревматоидного процесса наибольшую группу составили больные в возрасте 41- 50 лет, а при III степени отмечено смещение в сторону более молодого возраста (превалирует группа больных в возрасте от 31 до 40 лет).

По продолжительности заболевания отмечено следующее распределение больных РА: до 5 лет – 6 (4%) человек, 6-10 лет – 70 (49%), 11-15 лет – 54 (38%), 16-20 лет – 8 (6%), свыше 20 лет – 4 (3%). Средняя продолжительность болезни – 12,4±3,8 лет. Медленно прогрессирующий характер течения РА отмечен у 106 (75%), быстро прогрессирующий – у 36 (25%) больных.

Комплексное клинико-инструментальное и иммуно-биохими­ческое обследование больных позволило выявить у 44 (31%) больных РА системные проявления заболевания.

На основании рентгенологических исследований суставов (по О. Steinbrocker, 1949) у 10 (7%) больных установлена I стадия поражения, у 82 (58%) - II стадия, у 46 (32%) - III стадия и у 4 (3%) - IV стадия поражения суставов.

В связи с ослаблением функциональных возможностей суставов у больных РА и в соответствии с классификацией у 64 (45%) больных установлена I степень функциональной недостаточности суставов (ФНС-1), у 68 (48%) - ФНС-2 и у 4 (3%) больных - ФНС-3. Без нарушения функций суставов под нашим наблюдением находилось 6 человек (4%). Чаще отмечалось поражение мелких суставов кистей, стоп, лучезапястных и коленных суставов. У подавляющего большинства больных 136 (96%) выявлялся полиартрит. У 102 (72%) больных в сыворотке крови методом латекс-агглютинации обнаружен ревматоидный фактор (РФ).

Комплексное лечение больных РА проводилось по общепринятым методикам с учетом клинических особенностей болезни, степени активности патологического процесса, внесуставных поражений, характера течения заболевания. С целью изучения влияния различных видов проводимой в условиях стационара терапии на изучаемые показатели нами были подобраны четыре группы больных со II степенью активности патологического процесса и сопоставимыми клинико-лабораторными данными, которым проводилось следующее лечение: 1) нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) в сочетании с местным введением глюкокортикоидов (ГК) (внутрисуставно, периартикулярно) – 26 человек; 2) НПВП в сочетании с системным введением ГК (15–40 мг/с) – 21 человек; 3) НПВП в сочетании с плазмаферезом – 18 человек; 4) НПВП в сочетании с базисной терапией (метотрексат, делагил) – 24 человека.

Больные остеоартрозом

Под наблюдением находились 48 больных, из которых 30 (62,5%) женщин и 18 (37,5%) мужчин. Средний возраст больных ОА – 49,4±6,5 лет. Большинство находящихся под наблюдением больных (56%) было в возрасте свыше 50 лет.

По данным рентгенологического метода обследования I стадия поражения суставов установлена у 18 (38%), II – у 26 (54%) и III – у 4 (8%) больных ОА. Средняя продолжительность заболевания – 10,3±3,2 лет.

По степени функциональной недостаточности суставов больные распределены следующим образом: ФНС-0 – 7 (15%), ФНС-1 – 34 (70%), ФНС-2 – 7 (15%) больных. Нарушение функциональных возможностей суставов во многом связано с наличием синовита, явления которого выявлены у 27 (56%) больных ОА.

Олиго - и моноартроз выявлены у 11 (23%) больных, полиостеоартроз – у 37 (77%). Узелковая форма ОА обнаружена у 12 (25%), безузелковая - у 36 (75%). Локализация патологического процесса в суставах распределилась следующим образом: суставы кистей – 35 (73%), локтевые суставы – 12 (25%), плечевые – 11 (23%), суставы стоп – 16 (33%), коленные – 40 (83%), тазобедренные – 20 (42%), лучезапястные – 7 (15%).

В качестве антигена использовался коммерческий препарат АДА производства «Sigma», США (Cat. № А 5043) с активностью 130 Ед/мг, концентрация белка в нем составила 95,6 мг/мл. В ELISA-тесте использовался фермент в разведении 10 мкг/мл, для иммобилизации применялся раствор АДА с концентрацией 100 мкг/мл.

Антитела к АДА определялись иммуноферментным методом при иммобилизации антигена на микротитрационных полистироловых планшетах Immulon 2 (Dynatech Labs, Германия) и с использованием иммобилизированной формы магнитоуправляемых сорбентов (МС). Иммобилизацию АДА проводили методом эмульсионной полимеризации в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиакриламидного геля по методике с соавт. (1991).

Результаты учитывали на многоканальном спектрофотометре АС-8К при длине волны 450 нм, полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности (е. о.п.). Наличие антител считалось положительным при превышении значений оптической плотности на 2 средних квадратических отклонения от значений контрольной группы.

Для определения активности АДА в сыворотке крови использовалась методика Martinek R. G. (1963), основанная на калориметрическом определении аммиака с помощью фенолгипохлоритного реактива*. Лабораторное исследование включало: клиническое исследование крови, мочи, анализ основных биохимических показателей крови (в том числе общего белка, креатинина, мочевины, аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, билирубина и др.).

С диагностической целью, а также для оценки корреляции с изучаемыми показателями были проведены иммунологические пробы, позволяющих охарактеризовать иммунный статус больных РА. Методом радиальной иммунодиффузии в геле по Манчини определяли уровень сывороточных иммуноглобулинов - IgA, IgG и IgM. Антинуклеарный фактор (АНФ) исследовался по Кунсу (Г. Фримель, 1987). IgМ–РФ и С-реактивный белок (СРБ) выявляли с помощью теста латекс агглютинации. Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) определяли методом преципитации с полиэтиленгликолем 6000 по Haskova в модификации (1988) #.

Указанные исследования проводились унифицированными методами в биохимической (*) (заведующий - д. м.н., профессор ) и иммунологической (#) (заведующий - д. м.н. ) лабораториях ГУ НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН.

Эффективность лечения больных оценивалась с помощью одинаковых клинико-лабораторных и иммунобиохимических показателей. Статистическая обработка полученных результатов проводилась на персональном компьютере с использованием программных пакетов "STATISTICA 6.0", "Excel 5.0", "STATGRAPHICS 3.0", "Биостатистика". Достоверными считались результаты при уровне р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Изучение влияния специфических иммуноглобулинов на активность аденозиндезаминазы

Результат взаимодействия антител с ферментами может быть различным: АТ могут ингибировать ферментативную активность полностью или частично, усиливать или не изменять ее (S. V.Griffin, 1999). Предполагая, что антитела к АДА вызывают ингибирование ее ферментативной активности, мы провели in vitro опыты по изучению взаимодействия иммобилизированной и растворимой форм энзима с полученными предварительно антителами к АДА.

Активность растворимой формы АДА после взаимодействия со специфическими АТ снизилась более чем на 60%; различия с контрольной группой (физиологический раствор) и донорами достоверны (р<0,001). Уменьшение активности иммобилизированной формы АДА по сравнению с контролем произошло более чем в 1,5 раза; выявлены статистически достоверные различия с физиологическим раствором и донорами (p<0,001) (см. таблицу 2).

Таблица 2

Сравнительная характеристика активности растворимой и

иммобилизированной форм АДА после взаимодействия с антителами

Форма фермента	Активность фермента (МЕ) после взаимодействия
с чистыми антителами (n=30)	с сывороткой доноров (n=26)	с физиологическим р-ром (n=20)
Растворимая	18,6 ± 2,98	54,5 ± 4,16	61,9 ± 3,64
Иммобилизи-рованная	13,2 ± 2,17	48,6 ± 3,86	57,6±4,12

Параллельно в иммуноферментном методе были исследованы сыворотки крови больных РА (n=30) на наличие антител к АДА после взаимодействия со специфическим магнитоуправляемым сорбентом, в результате которого исходная концентрация антител к АДА (0,137±0,008 е. о.п.) уменьшилась почти в 3 раза (0,046±0,005 е. о.п.).